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分离模式类型—分离是由样品、填料以及洗脱液三者之间的关系来决定的(2)

本章是继“吸收模式”和“分配模式”后的关于“离子交换模式”、“体积排阻模式”以及“亲水作用色谱模式”等内容的说明。

离子交换模式

离子性物质,包括氨基酸和无机物离子会穿过ODS色谱柱而未被ODS分离。这些物质可以采用离子交换树脂进行分离。阴离子,如氯离子(Cl-)和硫酸根离子(SO42-)以及阳离子,如钠离子(Na+)和钙离子(Ca2+)则分别使用阴阳离子交换树脂进行分离。
尽管氨基酸是由-NH2(氨基,阳离子)和-COOH(羧基,阴离子)构成,但仍然可以通过阳离子交换树脂进行分离,并使用酸性洗提液抑制-COOH的分解。
成分在离子交换柱中移动的速度取决于变成离子的趋势和为确保稳定性粘合离子交换树脂的趋势。

尺寸排除模式

像合成树脂和蛋白质等大分子成分可使用筛子一样的填料,根据尺寸大小进行分离。这种填料呈球形并含有许多网眼状小孔。小分子可通过填料的这些小孔,但会花费很多时间,因为填料的小孔就像一个大迷宫。其间,不能进入填料小孔的大分子则在填料间移动,较早到达色谱柱出口。
可进入填料空隙的小分子,由于其分子大小各不相同,穿过色谱柱所花费的时间也各不一样。

当已知分子量的标准样品经过检测后,可绘制出校准曲线。校准曲线的纵轴表示分子量的对数,横轴表示洗脱时间(体积)。通过该校准曲线,可计算未知样品的分子量分布以及平均分子量。
上述分离模式被称作尺寸排除模式,即尺寸排除色谱法(SEC : Size Exclusion Chromatography)或凝胶渗透模式,即凝胶渗透色谱法(GPC : Gel Permeation Chromatography)。

亲水作用色谱模式

亲水作用色谱模式 (HILIC 是英语 Hydrophilic Interaction Chromatography的缩写形式)是一种基于亲水作用的分离模式。ODS模式根据亲水作用原理,采用低极性填料用于分离。亲水作用色谱模式采用硅胶或具有极性基团的高极性物质作为填料用于分离。 如把ODS视为反相分割模式,则亲水作用色谱模式可视为正相分割模式。对于ODS模式而言,可溶于水的成分较早被溶出,有时会造成分离不够充分。这种不充分分离可通过亲水作用色谱模式予以改进,原因是将可溶于水的成分推迟洗脱出来。为延迟洗脱,有机溶剂与水的混合物被用作高比率有机溶剂洗脱液。
例如,采用亲水作用色谱模式,使用氨基色谱柱进行糖类分析。由于该模式能够进行高比率有机溶剂分离,因此对使用液相色谱-质谱联用分析特别具有优势。