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日立高新技术在中国

对生物样品或含有大量杂质成分的样品进行分析时,有必要实施蛋白质或杂质成分的去除及浓缩等预处理。预处理操作对分析结果造成重大影响,是非常重要的因素。而且操作过程中的很多细节依靠分析人员的操作经验和熟练程度,因此进行“稳定的预处理操作”是极为重要的一步。

预处理方法,使用较为广泛的是固相萃取法或色谱柱切换法。
Chromaster系统采用了选择阀,由此可以通过色谱柱切换方式实现自动化预处理。 以血清中药物的分析研究为例进行介绍。

色谱柱切换方式来分析血中的苯妥英

样品制备

人体血清中添加苯妥英后,离心后取上清液,即可。

目的

研讨苯妥英分析的自动化预处理。

*
苯妥英为抗癫痫药,其有效血药浓度为10 - 20 µg/mL,血药浓度超过20 µg/mL以上被认为是中毒范围。

仪器配置

Chromaster 5110泵
Chromaster 5210自动进样器
Chromaster 5310柱温箱(装配2位6通阀)
Chromaster 5420紫外-可见检测器

色谱条件

流动相 (A) 50 mM KH2PO4-K2HPO4(pH6.9)/CH3CN=95/5
(B) CH3CN
*(A)/(B) = 65/35
流速 1.0 mL/min
色谱柱 HITACHI LaChrom C18 (5 µm) (4.6 mm I.D. x 150 mm) (P/N: 891-5050)
柱温 40°C
检测波长 210 nm

预处理条件

流动相 (A) 50 mM KH2PO4-K2HPO4(pH6.9)/CH3CN = 95/5
(B) CH3CN
*(A)/(B) = 95/5
流速 1.0 mL/min
进样量 20 µL
预处理柱 Mspak PK-4A(4.0 mmI.D. x 10 mm, Shodex)*注释1
柱温 40°C
*:
注释1:其特点为:色谱柱切换分析用预处理柱中,不保留蛋白质而只保留小分子物质。

色谱柱切换预处理法的研讨

对血清中的苯妥英(抗癫痫药)进行分析时,需要去除蛋白质等成分。
因此,研究讨论了用前处理柱去除蛋白质后只将苯妥英(目标成分)导入色谱柱的方法。

关于前处理柱条件的研讨(1)

目的

确认蛋白质的洗脱条件

预处理条件

流动相 (A) 50 mM KH2PO4-K2HPO4(pH6.9)/CH3CN=95/5
(B) CH3CN
*(A)/(B) = 95/5
流速 1.0 mL/min
进样量 20 µL
色谱柱 Mspak PK-4A (4.0 mmI.D. x 10 mm, Shodex)
柱温 40°C

结果

确认了蛋白质等成分未被色谱柱保留并得以洗脱。

预处理柱条件的研讨(2)

确认将目标成分(苯妥英)导入到色谱柱的条件。
苯妥英STD 10 mg/L(进样量20 µL)、检测波长254 nm。

预处理条件

流动相 (A) 50 mM KH2PO4-K2HPO4(pH6.9)
(B) CH3CN
流速 1.0 mL/min
色谱柱 Mspak PK-4A (4.0 mmI.D. x 10 mm, Shodex)
柱温 40°C

色谱柱条件的研讨

确认目标成分(苯妥英)被保留在色谱柱并得以分离的条件。
在苯妥英STD 10 mg/L(进样量20 µL)、检测波长254 nm。

色谱条件

流动相 (A) 50 mM KH2PO4-K2HPO4(pH6.9)
(B) CH3CN
流速 1.0 mL/min
色谱柱 LaChrom C18 (5 µm) (4.6 mm I.D × 150 mm)
柱温 40°C

结果

将苯妥英从预处理柱导入至色谱柱后,色谱条件设定为A/B = 60/40。

关于阀切换时间的研讨

  1. 将血清导入到预处理柱,确认去除蛋白质所需时间。(280 nm波长下检测蛋白质)
    →此次将阀切换时间设定为5分钟。
  2. 根据前述前处理柱条件的探讨结果,决定了流动相的比例。

通过色谱柱切换的分析结果

样品制备

人的血清中添加苯妥英标准样品(10 µg/mL)而成。

*
离心分离后的上清液上机测试


血清中的苯妥英的标准曲线(1 - 50 µg/mL)

此次通过自动化前处理,苯妥英的回收率达到了:85.3%,10 µg/mL上时的保留时间的重现性达到CV:0.04%,峰面积值的重现性达到CV:1.91%。
苯妥英的有效血药浓度为10 - 20 µg/mL,血药浓度超过20 µg/mL时,将被认为中毒范围,而此次已确认采用本方法,可以进行高精度分析。

注意:
本资料所示数据仅为测定例用数据而非可保证仪器性能的数据。
本仪器只是研究用仪器,而不是诊断、治疗或预防人或动物疾病的医疗仪器。

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