跳至正文

Hitachi

日立高新技术在中国

生物药品是指运用重组DNA技术或细胞培养技术生产的蛋白质类药品,其特征是以作为生物起源的高分子作为原料。关于其试验方法 和评价方法,已经提出数种方针和准则。
此次,我们将介绍作为生物药品鉴别方法之一的“肽图法”。肽图法是旨在进行蛋白质的特性解析、同一性或稳定性的评价、变异检 测的方法。为了对多个出现肽峰的LC色谱图的洗脱模式进行比较,良好的峰保留时间和峰面积的重现性将成为非常重要的因素。在此,我们以BSA和作为生物药品代表的抗体药物 (IgG)作为模型样品,使用LC测定其消化物,并对重现性进行了评价。

肽图法简介:

将蛋白质利用化学方法或酶进行消化,使用LC等仪器分离并检测 生成的肽断片,通过比较其色谱模式,确认构成蛋白质的氨基酸的变化。

*
肽图法是根据三大药典(USP、EP、JP),在共同协商的基础上规定的试验方法,收录于JP(日本药典)版的参考信息中。

BSA(牛血清白蛋白)消化物的测定例

色谱条件:

色谱柱 HITACHI LaChrom C18 (5 µm) (4.6 mm I.D. x 250 mm)
流动相 A)0.1% TFA/H2O(v/v)
B)0.1% TFA/CH3CN(v/v)
* Gradient
流速 1.0 mL/min
柱温 40°C
检测波长 UV 215 nm
进样量 10 µL

样品配制:

*
使用动态混合器

峰保留时间及峰面积重现性(n=6)

保留时间:

峰 No. 1 2 3 4 5
Average 13.579 23.998 30.508 34.488 44.911
SD 0.009 0.012 0.012 0.018 0.012
%RSD 0.06 0.05 0.04 0.05 0.03

峰面积:

峰 No. 1 2 3 4 5
Average 313951 477180 729175 922057 814068
SD 6957 11499 17599 22397 21035
%RSD 2.22 2.41 2.41 2.43 2.58

反复测定6次,峰保留时间的重现性(%RSD)在0.06%以下,峰面积重现性(%RSD)在 2.6%以下,获得了良好的重 现性。据此可知,利用肽图法能够进行高可靠性的色谱模式分析。

抗体药物(IgG)的结:

生物药品中利用抗体(免疫球蛋白)的抗体药物,多为具有糖链结构的糖蛋白,因其较高 的特异性和有效性而备受瞩目。虽然存在多种免疫球蛋白,但作为抗体药物而投入实际应用的主要是IgG,其特征为具有“Y”字型的四链体结构。H链、L链各2条,分别以S-S 键(二硫键)相连接,从而形成Y字型。

在此将IgG经过还原烷基化处理后利用胰蛋白酶进行消化,使用LC测定其肽断片,并对色谱模式中峰的保留时间和峰面积的重现性进行了评价。

IgG消化物的测定例

色谱条件:

色谱柱 HITACHI LaChrom C18(5 µm)(4.6 mm I.D. x 250 mm)
流动相 A)0.1%TFA /H2O(v/v)
B)0.1%TFA/CH3CN(v/v)
*Gradient
流速 1.0 mL/min
柱温 40°C
检测波长 UV 215 nm
进样量 10 µL

Sample Preparation

*
使用动态混合器

峰保留时间及峰面积重现性(n=6)

保留时间:

峰 No. 1 2 3 4 5 6
Average 10.960 11.934 22.716 26.630 34.979 43.647
SD 0.012 0.011 0.013 0.010 0.013 0.010
%RSD 0.11 0.09 0.06 0.04 0.04 0.02

峰面积:

峰 No. 1 2 3 4 5 6
Average 131165 80680 227672 135253 418818 200076
SD 2547 2585 6966 4474 16010 8164
%RSD 1.94 3.20 3.06 3.31 3.82 4.08

反复测定6次,峰保留时间的重现性(%RSD)在 0.1%以下,峰面积重现性(%RSD)在4.1%以下,获得了良好的重现性。据此可知,对于IgG消化物这类更为复杂的肽的测定,也能够进行高可靠性的色谱模式分析。

注意:
本资料所示数据仅为测定例用数据而非可保证仪器性能的数据。
本仪器只是研究用仪器,而不是诊断,治疗或预防人或动物疾病的医疗仪器。

Donwload Adobe Reader
要浏览PDF文件,电脑中需装有Adobe Systems Incorporated 公司的Adobe® Reader®