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在2011年4月生效的日本药典第16版中,针对异亮氨酸/亮氨酸/缬氨酸颗粒的鉴别试验,规定使用常规色谱柱以HPLC进行测定。
此外,关于其含量测定,规定使用茚三酮柱后衍生法进行测定。

使用 Chromaster 进行的鉴别试验

各成分的浓度:

成分名称 浓度 (mg/mL)
Val: 缬氨酸 1.10
Ile: 异亮氨酸 0.92
Leu: 亮氨酸 1.84

色谱条件:

色谱柱 HITACHI LaChrom C18(3 µm) (4.6 mm I.D. × 150 mm)
流动相 (A)/乙腈= 970/30 (v/v)
流速 0.9 mL/min
柱温 40°C
检测波长 UV 210 nm
进样量 20 µL
*(A)
将 31.2 g 磷酸二氢钠二水合物溶于1,000 mL的水中,加磷酸调pH值至2.8。
*
调整流速,使得缬氨酸的保留时间约为 2.5分钟。

样品的配制方法:

称量相当于 92 mg L-异亮氨酸的样品,以流动相溶 解并定容至100 mL。使用 0.45 µm 滤膜过滤,作为进样样品。

鉴别试验:

鉴别试验中得到的系统适用性如下,结果满足要求值。
此外,鉴别试验的要求事项 “峰的保留时间相等”也得到了如下确认。

标准样品的系统适用性

项目 系统适用性要求值 测定结果
系统性能 洗脱顺序 Val、Ile、Leu的顺序 OK
Ile-Leu 的分离度 1.5以上 2.55
系统的重现性 各峰保留时间的 相对标准偏差(n=6) 1.0%以下 0.05% (Va)
0.09% (Iie)
0.09% (Leu)

鉴别试验结果

成分名称 要求事项 标准样品的保留时间 (min) 样品的保留时间 (min)
Val: 缬氨酸 峰的保留时间相等 2.51 2.50
Ile: 异亮氨酸 4.11 4.09
Leu: 亮氨酸 4.51 4.50
*
本分析样品由庆应义塾大学药学部 创药物理化学讲座提供。

使用 L-8900 的定量法

各成分的浓度

成分名称 进样样品中的浓度(ng/20 µL)
Gly: 甘氨酸 (内标物) 400
Val: 缬氨酸 960
Ile: 异亮氨酸 800
Leu: 亮氨酸 1,600

标准分析法色谱条件

分析柱 #2622PH 4.6 mm I.D. × 60 mm
脱氨柱 #2650L 4.6 mm I.D. × 40 mm
流动相 PH Buffer Kit
流速 0.4 mL/min
柱温 57°C
反应液 Ninhydrin coloring solution kit for HITACHI
反应液流速 0.35 mL/min
反应温度 130°C
检测波长 VIS 570 nm
进样量 20 µL

样品的配制方法

称量相当于 0.95 g L-异亮氨酸的样品,加入 10 mL 内标溶液(甘氨酸)*,以 0.1 mol/L 的盐酸试液溶解并定容至 250 mL。
µm 滤膜过滤后,作为样品溶液。

*
内标溶液 甘氨酸的 0.1 mol/L 盐酸试液溶液(1 g/20 mL)

定量法:

含量测定中得到的系统适用性如下,结果满足要求值。
此外,将定量结果一并提供以作参考。
另外,测定条件中记载的市售试剂(流动相、反应液)与药典中规定的组成一致,因此无需配制,可直接使用。

标准样品的系统适用性

项目 系统适用性要求值 测定结果
系统性能 洗脱顺序 Val、Ile、Leu的顺序 OK
Ile -Leu 的分离度 1.2以上 1.37
系统的重现性 内标物(Gly)与各峰面积比的相对标准偏差(n=6) 1.0%以下 0.09% (Va)
0.17% (Iie)
0.09% (Leu)

定量结果

成分名 含有量/标示量 × 100(%)
要求值 测定结果
Val:缬氨酸 93.0 - 107.0 100.3
Ile:异亮氨酸 98.4
Leu:亮氨酸 100.4
*
本分析样品由庆应义塾大学药学部 创药物理化学讲座提供。

注意:
本资料所示数据仅为测定例用数据而非可保证仪器性能的数据。
本仪器只是研究用仪器,而不是诊断,治疗或预防人或动物疾病的医疗仪器。

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