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日立ハイテクサイエンス

第5回 分離モードとカラム(2)

液体クロマトグラフ(HPLC)基礎講座

分離モードの種類 - 分離は試料と充填剤・溶離液との三角関係で決まる! (2)

「吸着モード」「分配モード」に続き、「イオン交換モード」「サイズ排除モード」「HILICモード」について説明します。

イオン交換モード

アミノ酸のように水に溶けてイオンになる物質や無機イオンは、ODSに分配されないのでカラムを素通りしてしまいます。そこでこのような場合はイオン交換樹脂で分離します。 塩化物イオン(Cl-)や硫化物イオン(SO42-)のように陰イオンになる物質は陰イオン交換樹脂で、Na+やCa2+のような陽イオンは陽イオン交換樹脂で分離します。アミノ酸は-NH2(アミノ基:陽イオンになる)と-COOH(カルボキシル基:陰イオンになる)の両方を持っていますが、分離する際は酸性の溶離液を使用して-COOHの解離を抑えますので、陽イオン交換樹脂で分離します。 この場合も成分によってイオンになりやすいものと、イオン交換樹脂に結合している状態の方が安定しているものとがありますので、それによりカラム中を移動する速度が変わります。

サイズ排除モード

合成樹脂やたんぱく質のように分子量が大きい物質をODSカラムに注入すると、吸着してカラムから溶出しません。そこでこのような高分子成分を分離する場合は「ふるい」のような充填剤を用いて分子の大きさにより分離を行います。
球状の充填剤には中を貫通する網目のような穴があいており、その穴に入り込めるような小さな分子は充填剤の中を迷路のように通り抜けるので、通過するのに時間がかかります。 一方、穴に入ることができない大きな分子は充填剤と充填剤の隙間を通り抜けるので、カラムの出口に早く到達します。
穴に入り込める大きさの分子でも、大小によりカラムを通過するのにかかる時間に差が出ます。

分子量がわかっている標準試料を測定すれば、縦軸に分子量の対数、横軸に溶出時間(容量)をプロットした校正曲線を作成できます。これにより未知試料の分子量分布や平均分子量を求めることが可能です。
このような分離モードをサイズ排除(SEC:Size Exclusion Chromatography)、ゲル浸透(GPC:Gel Permeation Chromatography)とよんでいます。
低分子成分の分離と異なり、SEC/GPCは分子サイズにより分離しますので、同じような分子サイズを持つ複数のポリマー混合物を分離するのは困難です。

HILICモード

HILICはHydrophilic Interaction Chromatographyの略で、親水性相互作用を利用した分離モードです。ODSは充填剤の極性が低く、疎水性相互作用を利用して分離するのに対し、HILICモードではシリカゲルや極性基を持った極性の高い充填剤を用いて分離します。
ODSが逆相分配モードとすれば、HILICは順相分配モードと考えられます。ODSでは水溶性成分が早く溶出するため、十分な分離が得られない場合がありますが、HILICモードでは水溶性成分の溶出が遅れ、分離が改善されます。有機溶媒/水の混合溶液を溶離液として用い、有機溶媒の比率を高めることにより溶出が遅れます。
NH2カラムを用いた糖分析などがHILICモードに相当し、有機溶媒比率が高い状態で分離できるので、特にLC-MSでの分離に有利です。

カラムの選択

簡単に分離の機構について説明しましたが、どのように使い分けるのでしょう? カラムの選択基準と主な分離対象物質について、以下のリンク先に「カラム選択の手引き」を掲載しています。カラム選択時の目安としてご活用ください。