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株式会社 日立ハイテクノロジーズ

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急速凍結法や凍結乾燥のところですでに述べたように、物性の保存には凍結固定が優れているが、普通の凍結過程では電子顕微鏡レベルの微細構造の維持は難しい。この方法の実質的開発者であるChristensen AK(1971)は液体窒素で冷却した銅ブロックへの圧着凍結をおこない、圧着表面の凍結良好部分から切片を作り、凍結乾燥し構造観察をおこなった。微細構造はエポン包埋にはかなわないものの物性保存は優れており、その後X線微小分析や組織化学などに応用された。
今日、免疫細胞化学のための最良の方法として 誰もが活用できるようになったのは徳安清輝(Tokuyasu KT)博士の功績である。切片の作製から免疫標識に至るまで多くの点において改良というよりは開発し、凍結切片といえば徳安法というほど普及している。
アルコールによる脱水過程を経ないために、タンパク質の変性が極力抑えられること、および樹脂に包埋しないために抗体が抗原に対し、三次元的に作用できることから効率良い標識が可能である。
前章で解説した樹脂包埋試料の免疫標識に比べ、倍以上の効果があると言われている。一方、加圧凍結法など新しい急速凍結法の発展や、ごく最近の周辺技術の発展は、この凍結切片法にもおおききな変化をもたらしつつある。それはこの方法の開発当初から考えられていた構造解析のための凍結切片法の発達である。
急速凍結によりアモルファス氷に包埋された組織の超薄切片は、いっさいの前処理をしないで細胞内の超微細構造を観察できる唯一の試料作製法となる。勿論クライオトランスファーやクライオ電子顕微鏡など、特殊で高価な装置が必要であるが、単粒子解析やトモグラフィーと組み合わせることにより細胞内で機能中の分子構造を捉えることが出来る。
ここではまず古典的な免疫細胞化学のための徳安法を紹介し、次に新世代の凍結切片法について解説する。

(1)免疫凍結超薄切片法

ここでは組織を対象とするクラシカルな徳安法を基盤とした一般的な方法を解説する。固定、凍結、切片製作、免疫標識という一連の流れに沿って記述する。

準備するもの:

  • 目的とする組織試料
  • 固定液
    (HEPES緩衝液(NaHCa)中で2%パラフィルムアルデヒド+0.1%グルタールアルデヒド混合)
  • PBS
  • 0.15M グリシンを含むPBS
  • 12%(w/v)ゼラチン(0.1M HEPES緩衝液中)37℃
  • 2% and 5%(w/v)ゼラチン(0.1M HEPES緩衝液中)37℃
  • 2.3M sucrose(0.1M HEPES緩衝液中)
  • パラフィルム M
  • 剃刀の刃
  • パスツールピペット
  • スクリューキャップのあるガラス瓶
  • 先の揃ったピンセット
  • 実体顕微鏡
  • 遠心器
  • 回転シェイカー
  • 液体窒素
  • ウルトラクライオミクロトーム

プロトコール:

1. 固定

脱水しないので比較的軽い固定をおこなう。
我々は前述のHEPESベースのNaHCa緩衝液(outside buffer)中に2%パラフォルムアルデヒドと0.1%グルタールアルデヒドを混ぜて、固定液として使用している。
GPIアンカータンパク質のように固定に弱いタンパク質は、グルタールアルデヒドを用いないで4%パラフォルムアルデヒド(緩衝液中)で固定する。固定時間は約2時間であるが、30分ほど経過したら、試料を1mm角ぐらいの大きさに細切する。

2. 凍結時における氷晶形成防止のためのショ糖液浸透

急速凍結ではなく、クラシカルな液体窒素への浸漬凍結では氷晶形成防止剤を使用する必要がある。
ここでは組織が軽く固定されていることと物性を保存するためにグリセロールなどは用いず、2.3 Mショ糖液を用いる。

  1. 固定後0.15Mグリシンを含むHEPES緩衝液で5分間、3回洗浄する(グリシンは固定剤のクエンチングのために用いられるのであるが、著者の経験では必ずしも必要としない)。
  2. 凍結切片の切削性を改良するために、まず、HEPES緩衝液に溶解させた12%ゼラチンに浸透させる。浸透を確実にするため、2%、5%ゼラチン溶液にそれぞれ30分浸漬した後、12%ゼラチン溶液に30分2回浸漬する。
    ゼラチン溶液の温度はゼラチンを溶解させる時は50℃くらいでも良いが、組織に浸透させる時は37℃程度にする。
  3. パラフィルムの上に12%ゼラチン溶液滴を取り、続いてゼラチンが浸透した試料組織をそこに入れる。
    試料が乾燥しないようにしながら、濾紙で極力余分なゼラチン液を吸い取り、直ちにパラフィルムごと氷の上に載せる。こうすると試料に含まれているゼラチンは固まり、あたかもゼラチンに包埋されたようになる。ゼラチンで覆われた試料は氷温の緩衝液中で一時的に保存する。
  4. ゼラチンに包埋した試料を2.3Mのショ糖液で満たされた、バイアル中に投入し、4時間以上浸透させる。この過程はコールドルーム中でシェイカーなどを用いて、良く回転震盪させると良い。コールドルームが無い時は氷を入れた容器の中に管瓶を立て、容器とともに水平回転、あるいはシーソーシェイカーに載せて震盪させると良い。

3. 試料の凍結

ショ糖液に浸透させた試料を凍結切片用のミクロトーム試料台(ライカ社の場合はアルミ製で釘の頭のような形)に載せる(図1)。試料台の表面は紙やすりで少しざらつかせておくと、ショ糖液が金属表面に良くなじみ、切削中の試料の落下を防げる。
余分なショ糖液を濾紙で吸い取り、ただちに試料台ごと液体窒素につけ凍結する。凍結試料は液体窒素中で保存する。

4. 凍結切片の製作

クライオウルトラミクロトームのマニュアルに従い、凍結切片製作の準備を進め、凍結試料をミクロトームに装着する。トリミング用ナイフは硝子でも良いが、ダイアトーム製のトリミングナイフを勧める。
チャンバー内の温度は-100℃に設定する。まず、試料全面を200nm程度の厚さで切削し、試料全面を露出させる。その後、ナイフを左右に振り、試料も回転させ側面(エッジ)についても100µmほど削り、試料ブロックの全面とエッジ部分が鏡面状に仕上がっていることを確認する。試料表面の大きさは0.25×0.5mm位が切りやすい。
トリミングが完了したら、トリミング用ナイフを予めチャンバー内で冷却しておいた、クライオ超薄切片用のダイヤモンドナイフと交換し、超薄クライオ切片を作製する。この時チャンバー内の温度を少し下げ、-110℃にする。
切削速度は1~2mm/secとする。ゴールドの干渉色を示す70~100nmの厚さの切片がリボン状に繋がって切れてくれば成功である。
ダイヤモンドナイフの刃先角は切削時の圧縮を軽減するために35度を推奨する。また、リボン状に切片を導き出すコツは1~2枚、オプラート状の切片が出始めたら、図2のように超薄切片法でも使用した睫毛道具(eyelash tool)の先端で少し切片を持ち上げて、ナイフ斜面にくっつかないようゆっくり引くと、次々と切片が繋がって出てくる。

5. グリッドへのマウント

グリッドはフォルムバール支持膜を張りカーボン蒸着し、予め親水化処理をしておく。切片の構造を傷つけず乾式でグリッド上に載せるのは至難の技であったが、徳安法ではショ糖滴を使うことでこれを成し遂げた。
2~3mm 白金またはステンレスループでショ糖液をすくうと表面張力の関係で、球状になる。ショ糖滴はチャンバー内で1~2秒で凍結直前まで冷却される(5秒以上おくと表面から凍ってしまうので注意)。これを切片に軽く接触させると、切片は瞬間的にショ糖滴の表面へ乗り移る(図3)。うまくいくとリボン状の切片の並びを崩さずに、そっくり切片をショ糖滴に移すことができる。なお、この時ショ糖滴はナイフの斜面上に並ぶ切片を触る程度とし、刃先には触れないようにする。刃先に触れると次から切れなくなるので、ナイフを洗浄し最初からやり直すことになる。
さて、ショ糖滴に移った切片は多くの場合表面に存在するので、実体顕微鏡下で良く確認しながら(図4)、グリッドを近づけ、接触すると切片はグリッドに張り付く(図5)。切片を回収するショ糖液は純粋なものでも良いが後のことを考え、PBS中で2.3Mショ糖液と2%(v/v)メチルセルロース水溶液(蒸留水で溶解)を1:1で混ぜて使用している。
グリッド上にマウントされた切片はショ糖-メチルセルロースで覆われており、この溶液中に保存すると4℃で2週間ほど維持できる。

免疫標識

免疫標識は前章の樹脂包埋切片の免疫標識と同様に、パラフィルムを実験台に貼りその上に洗浄液あるいは抗体などの水滴を載せ、この水滴にグリッドを浸して反応させることになる。グリッドは水滴中に沈めないで浮かせた状態で反応させる。すなわち、切片は常に下面で水滴と接しており、上面は乾燥した状態になっている。

準備するもの:

  • グリッドに載った凍結切片
  • 2%(w/v)ゼラチンを敷いたシャーレ(2.5~3cm径)
  • 0.15Mグリシンを含むPBS
  • 1%BSAを含むPBS
  • 0.1%BSAを含むPBS
  • 一次抗体
  • 金コロイド二次抗体または金コロイドプロテインA
  • グルタールアルデヒド
  • メチルセルロース/ウラニルアセテート液
    (Methyl cellulose/uranyl acetate solution)
  • パラフィルム(Parafilm M)
  • 濾紙(できればWhatman #50)
  • 37℃ incubator
  • ピンセット
  • 白金またはステンレスループ(2mm径と3.5mm径)

プロトコール:

  1. 2%ゼラチン水溶液を2.5cmシャーレに深さ3mmぐらいまで注ぎ、4℃で固化させておく。
  2. ショ糖-メチルセルロースで覆われて4℃にて保存しておいたグリッド上の凍結切片を、このゼラチンプレートの上に切片を下向きにして、すなわちゼラチンと接触するように載せる。この状態で37℃まで温度を上昇させ、30分間静置する。
    前もって凍結切片を容易にするために試料組織に浸透させた12%ゼラチンは2%ゼラチン中に溶出し、濃度が希釈される。
  3. パラフィルムを実験台の上に貼り、その上に0.15Mグリシンを含むPBSを100µLずつ5滴用意する。試料面を下にしてメッシュを載せる。各1滴あたり2分間で、合計5回(10分間)洗浄することになる。
  4. ブロッキング
    1%BSAを含むPBSを100µLとり、その上にグリッドを移し3分間静置する(図7)。

  5. 一次抗体との反応
    目的とする抗体を1%BSA/PBSで希釈し、その10µLをパラフィルム上にとり、グリッドを載せ、1時間インキュベートする。
  6. 0.15Mグリシンを含むPBSを100µLとり、3分間静置し、洗浄する。これを4回くりかえす。5回目の洗浄は0.1%BSAを含むPBSを100でおこなう。
  7. 金コロイド二次抗体との反応
    我々は10nm金コロイドのついた二次抗体をよく使用する。
    市販の金コロイド二次抗体を使用する場合は1%BSA/PBSでおよそ25倍に希釈する。その10µLをパラフィルム上にとり、グリッドを載せ、30分間インキュベートする。勿論一次抗体がウサギで免役した物ならば、ヤギ抗ウサギ金コロイド二次抗体を使用し、一次抗体がモノクローナルのようにマウス由来ならば、ヤギ抗マウス金コロイド二次抗体というように変化させなければならない。このような手間がかからないのがプロテインAゴールドである。プロテインAゴールドの場合も同様に1%BSA/PBSでOD 0.1%に希釈し使用する。
  8. PBS 200µLをパラフィルム上に8滴とり、各1分間グリッドを載せ洗浄する。
  9. 1%グルタールアルデヒド/PBSを50µLとり、標識抗体と抗原との結合を固定する。
  10. 蒸留水(ミリQ水)500µLをパラフィルム上に8滴とり、各1分間グリッドを載せ洗浄する。
  11. グリッドの包埋
    メチルセルロース/ウラニル液100をパラフィル上に滴下し、蒸留水で洗浄後のグリッドを1分間のせる。さらに新鮮なメチルセルロース/ウラニル液滴100をつくり、その上に5分間浮かせる。その後グリッドより少し大きめの白金、またはステンレスループを用いて、グリッドをすくい取る(図8)。
    ループを90度立て、ループの端を濾紙に触れさせ、ゆっくりと引くとメチルセルロース/ウラニル液は徐々に減少し、グリッドが薄膜を介してループに支えられているようになる(図9)。
    最後まで除去するのではなく、この時点で止める。この後空気乾燥してから、透過電子顕微鏡で観察する。濾紙は吸収が遅いほうが良く、米国ではwhatmanの#50を使用している。ペーパータオルでも代用できる。

メチルセルロース/ウラニル液の作り方

<メチルセルロース(ストック)液>
実験の数日前に作製しておくこと。
メチルセルロース2gを90℃まであたためた蒸留水98mLに投入し、撹拌して完全に溶解させる。さらに氷上で撹拌しながら10℃まで冷却する。その後はコールドルームやコールドチャンバー内で一晩撹拌する。その後は撹拌せず4℃で3日間ほど静置する。
この上澄みを保存液(stock solution)としてもいいが、できれば100,000gで遠心し、その上澄みを保存液とする。冷蔵庫内で3ヶ月間ぐらいは保存がきく。
4%ウラニルアセテート水溶液とメチルセルロース溶液を1:9の割合で混ぜてメチルセルロース/ウラニル液とする。(5mLのメチルセルロース/ウラニル液を作るためにはメチルセルロース(ストック)液4.5mLに0.5mLの4%ウラニルアセテート水溶液をまぜる)

参考文献

*
Christensen AK:
Frozen thin sections of fresh tissue for electron microscopy, with a description of pancreas and liver. J. Cell Biol. 51: 779-804 1971
*
徳安清輝:
免疫凍結切片法 日本電子顕微鏡学会第48回学術講演会
予稿集 64-75 1992
*
Peter JP:
Cryo-immunogold electron microscopy
Curr. Proto. Cell Biol. 4.7.1-4.7.19 2006
John Wiley & Sons, Inc
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