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株式会社 日立ハイテクノロジーズ

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(2) 一般的な化学固定法と実践技術

構造観察のためには二重固定が一般的である。
前固定にはグルタールアルデヒド固定液、後固定にはオスミウム酸固定液を用いる。これはそれぞれの浸透性、固定効果の違い(短所)を補うためである。
さらに現在では大半の研究者が前固定液としてグルタールアルデヒド単独ではなく、パラフォルムアルデヒドとの混合液(いわゆるKarnovskyの固定液)を使用している。ただ、それぞれの濃度はオリジナルの1/2濃度のことが多いのでhalf Karnovskyなどと呼ばれている。すなわち0.1M緩衝液(buffer)(pH7.4)中に2.5%グルタールアルデヒド、2%パラフォルムアルデヒドとなるように希釈された固定液である。
ここでどの緩衝液を選ぶかが各研究者により多少異なる。たかが緩衝液と思うかもしれないが、実はこの緩衝液次第で固定効果もかなり異なるのである。
最も一般的なリン酸緩衝液はCaの沈着を起こし形態の保存には再現性があまり良くない(一定でない)ので薦められない。私のところではこれまでもっぱらカコジル酸緩衝液を使用してきた。これは作製法が簡単な上、かなり安定した結果が得られるからである。しかし、カコジル酸はヒ素を含んでおり、毒物に指定されているので、試薬の管理、廃液の処理には十分な注意が必要である(使用に際しては各所属の管理・処理規定にしたがう)。
そこで我々の研究室ではHEPES緩衝液を最近使用している。HEPESには二重結合やアミンが存在するので一見固定液と反応するのではと危惧されるが、グルタールアルデヒドやパラホルムアルデヒドの緩衝液として前固定に用いた時にはカコジル酸緩衝液よりむしろ良い固定効果を示した。特に培養液に直接接している培養細胞には毒性がないこともあり、HEPES緩衝液を用いた固定液での固定結果は安定性、再現性に優れていた。
ここではこの2つの緩衝液を用いた固定液の作り方を紹介する。

緩衝液、固定液の作り方

<(a)緩衝液のStock solution(実際使用する溶液の2倍濃度で作製する)>

0.2Mカコジル酸緩衝液(500mL)の作製法

準備するもの:

  • 0.2N HCl溶液
  • カコジル酸ナトリウム
    (Sodium Cacodylate:Na(CH32AsO2:試薬特級)
  • 純水
  • 500mL ビーカー
  • 500mL メスシリンダー
  • スターラー
  • pHメーター
  • パスツールピペット

作製手順:

カコジル酸ナトリウム21.4g(TAAB社のEM grade試薬の場合)を500mLビーカーにとり、350mLの純水を入れ、スターラーで撹拌溶解する。pHメーターでpHを測定しながら0.2N HCl溶液をパスツールピペットでとり、滴下しながらpHを7.4~7.5の間に調節する。ビーカーの液を500mLメスシリンダーに移し、純水を加え全体量を500mLとする。(図1)

60mM HEPES緩衝液(1,000mL)の作製法

組成:

60mM HEPES、200mM NaCl、4mM CaCl2(pH7.4)

準備するもの:

  • 1N NaOH溶液
  • HEPES(N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]試薬特級)
  • NaCl
  • 1M CaCl2
  • 純水
  • 1,000mL ビーカー
  • 1,000mL メスシリンダー
  • スターラー
  • pHメーター
  • パスツールピペット

作製手順:

HEPES 14.3g(Sigma社製の場合)、NaCl 11.7gを1,000mLビーカーにとり、800mLの純水を入れ、スターラーで撹拌溶解する。十分溶解したら撹拌しつづけながらpHメーターでpHを測定する。1N NaOH溶液をパスツールピペットでとり、滴下しながらpHを7.4に調節する。pH調整後1M CaCl2を4mL加える。この時一度に入れないこと、撹拌しながら、少しずつ滴下する。最後にビーカーの液を1,000mLメスシリンダーに移し、純水を加え全体量を1,000mLとする。(図2)

<(b)固定液のStock solution>

グルタールアルデヒドについては市販のものを直接希釈して使用するので保存用(stock solution)を作る必要はない。

10%パラフォルムアルデヒド水溶液(Paraformaldehyde stock solution)100mLの作製

パラフォルムアルデヒドは純水にはほとんど溶けないので前もってアルカリ熱溶解しておく必要がある。

準備するもの:

  • 1N NaOH溶液
  • パラフォルムアルデヒド(Paraformaldehyde試薬特級)
  • 純水
  • 200mL 三角フラスコ
  • 100mL メスシリンダー
  • パスツールピペット
  • 加熱装置つきスターラー
    (または熱湯の入ったバットとスターラー)

作製手順:

パラフォルムアルデヒド10gを三角フラスコにとり、純水70mLを入れ、撹拌しながら湯浴加熱する(60℃まで)。加熱は温度計で測りながら60℃を超えないようにする。溶液の温度が60℃近傍に達したら1N NaOH溶液をパスツールピペットにとり、滴下し、溶解する。2~3mLほどの滴下で透明な溶液となる。透明になれば十分であるのでNaOHを過剰に入れないよう注意する。さらに純水を加え全体量を100mLとする。ごくわずかであるが不溶成分が残る場合は#1の濾紙で濾過する。冷蔵庫に入れておけば2ヶ月は保存できる。(図3)

2%オスミウム酸水溶液

オスミウム酸は非常に強い固定効果と形態の保存がいいので形態観察のための後固定液の定番として使用される。
最近は4%水溶液としても市販されているので形態を頻繁に観察するのでなければこれを用いて直接緩衝液で希釈して固定に用いても差し支えない。

準備するもの:

  • オスミウム酸結晶 1g
  • 純水
  • 50mL 栓付きメスシリンダー

作製手順:

ゴム手袋をし、オスミウム酸結晶の入ったアンプルのラベルを剥がし表面をよく洗い、糊などを落とす。アンプルカッターでアンプルを割り、中のオスミウム酸結晶1 gを50mL栓付きメスシリンダーに入れる。時々結晶がアンプルに付着し、とれにくいことがある。その時は割れたアンプルごとメスシリンダー入れる。純水を加え全体を50mLとする。
オスミウム酸結晶は常温では溶けにくいのでメスシリンダーを60℃で湯浴する。結晶が油滴状になったら、メスシリンダーを振るとよく溶ける。完全に溶けると淡いうす黄色の溶液になる。

保存法:

栓の周囲をパラフィルムで厳重に巻き冷蔵庫に保存する。溶液はコンタミがなければ1年以上保存可能である。コンタミがあると溶液は1週間ほどで黒くなり使用できなくなる。
また、パラフィルムで栓の回りを覆っても少しずつオスミウムガスがでて1年ぐらいたつと冷蔵庫がどことなく薄黒く汚れてくるので、汚れてもいい小さな冷蔵庫をオスミウム専用として用意するといいだろう。

<(c)使用固定液(fixative)の作製法:使用する直前に調整する>

前固定液(fixative for pre-fixation)half Karnovsky固定液

組成:

2%グルタールアルデヒド、2%パラフォルムアルデヒド、0.1Mカコジル酸緩衝液または30mM HEPES緩衝液

前固定液50mLの作製手順

これまでに作ったstock solutionを以下のように混合して作る。(図4)

  • 25%グルタールアルデヒド4mL
  • 10%パラホルムアルデヒド10mL
  • 0.2M カコジル酸緩衝液または60mM HEPES緩衝液25mL
  • 純水11mL

後固定液(fixative for pre-fixation)オスミウム酸固定液

組成:

1%オスミウム酸、0.1Mカコジル酸緩衝液

後固定液10mLの作製手順:stock solutionを以下のように混合して作る。

  • 2%オスミウム酸水溶液5mL
  • 0.2M カコジル酸緩衝液5mL

後固定液は必ずネジフタ付きガラス瓶に入れる。

次回は固定の方法から包埋までを取り扱います。
これまでに名前の出てきた歴史的論文を参考までに下に書きます。

  • Karnovsky, MJ:
    A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.
    J Cell Biol, 27:137A(1965)
  • Luft JH:
    Improvement s in epoxy resin embedding methods.
    J. Biophys.and Biochem.Cytol, 9: 409-414(1961)

コラム

その他の緩衝液について

カコジル酸緩衝液とHEPES緩衝液について書いた。最近私の研究室では前固定液に用いる緩衝液はほとんどHEPESである。それで充分であるし、また一番良いと考えている。何十年も昔は酢酸ベロナール緩衝液、リン酸緩衝液、S-コリジン緩衝液などなど様々な緩衝液を用いていた。さらに固定剤の種類により緩衝液を使い分けるため、前固定と後固定では緩衝液が異なることもある。現在でもよく使われるリン酸緩衝液でも研究者により少しずつその処方が異なっていた。ここではSoerensenのリン酸緩衝液とMillonigのリン酸緩衝液についてその作り方を記載する。

Soerensenのリン酸緩衝液

A 0.2M リン酸一水素ナトリウム(Na2HPO4)Stock solution
B 0.2M リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4)Stock solution

A、Bのストック液を作製しておき、pH7.4の緩衝液100mLつくるにはA液40.5mLとB液9.5mLと純水50mLを混合すればいい。
(pHを正確に合わせるにはA液にB液を混ぜるときにpHメーターで測定しながらおこなう)

Millonigのリン酸緩衝液

A液:2.26% リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4)Stock solution
B液:2.52% 水酸化ナトリウム(NaOH)Stock solution

pH7.3の緩衝液100 mLつくるにはA液83mLとB液17mLを混合する。
(pHを正確に合わせるにはA液にB液を混ぜるときにpHメーターで測定しながらおこなう)

固定の方法:還流固定と浸漬固定

微細構造観察のための固定はアルデヒド系固定液による前固定とオスミウム酸固定液による後固定の二重固定を行う。
オスミウム酸は優れた固定剤で30年以上前には単独固定も行われた。しかし、固定作用が強すぎることもあり、アクチン線維など消失する構造があるため、現在では単独で用いることはほとんどない。
一方、グルタールアルデヒドも酵素活性や抗原性を残しながら多くの構造を保存する優れた固定剤であるが、オスミウム酸に比べ固定効果は弱く、単独で用いると脱水過程で多くの構造が失われてしまう。
そこでこれら2つの固定剤の長所を生かすため脱水前の二重固定が一般的となった。
さらに現在では前固定液にパラフォルムアルデヒドも加えられ、より保存性が増している。

灌流固定と浸漬固定

浸漬固定は言葉どおり細切した組織を固定液の入った小瓶に投入して固定する方法で、灌流固定は心臓から固定液を注入し、血管網を通して各組織に固定液を循環させ速やかに固定する方法である。
主に大型の哺乳動物の固定に用いられるが、肝臓や腎臓など血液で満たされている臓器を観察するときにはマウスなどの小動物でも簡便な灌流方法で固定している(図5)。
いきなり固定液を注入すると血液が凝固するので、ヘパリンを含むリンゲル液で血液を洗い流してから固定液を注入する。しかし、マウスのような小動物ではこのようなことをせず、いきなり固定液を満たした注射器を心臓に刺し、注入する。灌流固定といってもその後いきなりオスミウム酸で後固定するのではなく、組織を剖出後改めて前固定液に浸漬し十分固定する。
我々の研究室ではカエル、イモリ、などの両生類、またヒヨコなどの鳥類はすべて浸漬固定とし、マウスをはじめ哺乳類は灌流固定をしている。

前固定の実際

簡単な浸漬固定

準備するもの:

  • 前固定液(前項で紹介したHEPES緩衝液(またはカコジル酸緩衝液)に溶解した2%グルタールアルデヒド+2%パラフォルムアルデヒド(Half Karnovsky)20~50mL
  • リンゲル液(Mammalian Ringer)
  • サンプル管(ネジ口のガラス小瓶:我々は日電理化のSV8を使用している)サンプル数に応じて数本
  • ハサミ
  • カミソリ
  • ワックスプレート
  • ピンセット(細身のSS型が便利)
  • 実体顕微鏡

動物を麻酔などで不動化し、目的とする器官を剖出し、組織を手早く取り出す。
リンゲル液(Mammalian Ringer's solution)またはPBS(phosphate buffer saline)で付着した血液を洗浄し(数秒)、固定液に浸す。
ワックスプレート上に固定液を数滴載せそこに組織を置き、カミソリで細切する。最初は3~5mm角のブロックとし、半分ほど固定液で満たされているサンプル管に移す。
5分ほどすると試料組織が堅くなるので、再びワックスプレート上に取り出し、実体顕微鏡下で観察しようとするところを切り出す(1mm×1mm程度に細切する)。
細切した組織をサンプル管に戻し、約2時間固定する。
前固定の状態で長時間保存(1ヶ月程度)が可能であるが、やはり保存状態は時間とともに劣化するのですぐに次の処理に進むべきである。

簡単な灌流固定(マウスに適用)

右(図5)のように深麻酔下のマウスの四肢をテープで解剖皿の底面に固定する。
胸部の皮膚を剥ぎ、肋骨と横隔膜の位置がわかるようにする。出血を防ぐため、横隔膜を切らないようにする。
胸骨の左側を切り、横隔膜の上縁に沿って肋骨を切り、さらに外側から斜めにハサミを入れ左前胸部の一部を取り除くと動いている心臓を観察できる。
10mLの注射器に24号の針を付け、10mLの前固定液を入れる。
心臓の心尖部に針を刺し、固定液を注入する。全身に固定液が循環すると硬直するのですぐわかる。灌流固定後はすぐに必要な試料組織を切り出し、浸漬固定をおこなう。

正式な灌流固定

固定液の注入には低速のペリスタルポンプを用いるかまたは落差エネルギーを利用して注入する。
実際にはあまり使用しないのでここでは図のみを掲げる(図6)。

Mammalian Ringer氏液(リンゲル液)1Lの実際の作り方

リンゲル液の組成:

  • 155mMNaCl
  • 3mMKCl
  • 2mMCaCl2
  • 1mM&MgCl2
  • 3mMNaH2PO4
  • 5mMHEPES
  • 10mMGlucose

作製手順:

1LのビーカーにNaCl 9.06g、KCl 0.22g、NaH2PO40.36g、Glucose 1.80g、HEPES 1.2gを入れ、蒸留水800mLを加えスターラーで撹拌する。完全に溶けたら、1M MgCl2水溶液1mLと1M CaCl2水溶液2mLを加える。
次に撹拌しながら1N NaOHをパスツールピペットで少しずつ数ml注ぎpHを7.2~7.4に合わせる。この時1度に入れないこと、撹拌しながら少しずつ滴下する。
そうしないとCaが析出し濁ることがある。最後に、1Lのメスシリンダーに移し、純水を足して全体で1 Lとする。

PBS 1Lの実際の作り方

PBS(phosphate buffer saline)の組成:

  • 10mM リン酸緩衝液
  • 0.9% NaCl

作製手順:

1Lのメスシリンダーに前のコラムに書いたSoerensenの0.2Mリン酸緩衝液 50mL、NaCl 9.0gを入れ蒸留水を足して1Lとする。
しかし、現在では薬品会社から粉末あるいは錠剤のPBSが市販されているので、それを買い求めるのが一番便利である。決められた量の蒸留水に溶かせばいい(一袋1L用が多い)。

コラム

麻酔のかけ方

米国などでは動物愛護団体の訴えで動物実験が困難になっている。その一つが痛みによる動物への虐待である。英語では研究で動物を殺すことをbe sacrificed with(or by)---のように書くが、このwith(or by)---以下が重要で不用意に書くと大変なことになりかねない。したがって、under deep anesthesiaとか言う言葉で対処する。中枢麻酔により安楽死をさせなければならない。一般に麻酔薬は量依存的に効果を発揮するので、必要に応じて量を加減する。ラット、マウス、モルモットなどの場合、あらかじめ密閉した容器の中でクロロフォルムやエーテルで麻酔してからネンブタール注射液(ペントバルビタールナトリウム50mg/mL液)を用いる。マウスの場合はこのネンブタール注射液を10倍に希釈し、体重10gに対し0.1mLの割合で注射していた。また、300gのラットの場合は希釈せず、原液を0.3mL注射した(大きさや効果により適宜増減する。我々は状況を見ながら2~3回に分けて打っている)。灌流固定でない場合は試料組織の摘出後、そのまま目覚めることなく死亡させなければならない。しかし、最近では上述のネンブタールやエーテルは鎮痛効果が低いと考えられており、単剤ではなく複数の麻酔薬が用いられている。米国NIH(1987年)で猿を灌流固定した経験を持つが、その時は獣医がロンポルとケタミンで麻酔した猿を運んできた。手術台の上に寝かせてからさらにネンブタール原液8mLを長い注射針を用いて皮膚から直接心臓めがけて注射し、ほぼ脳死状態にしてから手術をはじめた。4Lの固定液とリンゲル液が必要であった。このように米国では獣医が付き添い、安楽死を確かめることがあるが、日本ではまだ少ない。しかし、麻酔薬そのものが獣医学部や医学部以外では入手が困難であるから、実験目的に応じて、獣医師にどのように麻酔をしたら良いかを相談するのが賢明である。なお、私は米国視覚眼科研究学会(ARVO)に所属しており、学会はanimal useに関してstatementを出しているので、必ず、Materials and Methodsのところで、以下の文章を書いている。
This study was conducted in accordance with the ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. All protocols were approved by the Institutional Review Board of the ---- University, Graduate School of Medicine.

ARVOのStatementはNIHのガイドライン、Guide for the care and use of laboratory animalsに準拠しているので、これを参考にしても良い。NIHのホームページから見ることができるが、200ページ以上におよぶので必要なところをダウンロードするとよいだろう。また、それぞれの大学のanimal useに関するreview boardの意見に沿う必要もある。なお、参考までに、ARVOのStatementの一部"Guidelines for the conduct of experiments"を掲載する。しかし、麻酔薬の具体的な名称は出ていない。

Guidelines for the conduct of experiments

The quality of the information obtained through research depends in no small measure on the health and general condition of the animals used. Proper animal husbandry is fundamental to the success of any research effort that uses animals.

Research animals must be obtained and cared for in accordance with the recommendations of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, the Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals, and in Canada, the Guide to the Care and Use of Experimental Animals by the Canadian Council of Animal Care (if conducting research in Canada).

Experienced investigators can contribute very valuable information about the care of animals rarely used in the laboratory and about the use of animals in particular experimental situations.

Investigators in the United States must comply with relevant local, state and federal laws, including the U.S. Animal Welfare Act, as amended, and its accompanying regulations. An Institutional Animal Care and Use Committee must review and approve the use of animals in vision research in the United States and Canada.

Surgery should be carried out or directly supervised by persons with appropriate levels of experience and training, and surgery performed on animals that will survive (for example, on animals intended for long-term studies) should be undertaken with careful attention to aseptic technique and prevention of infection. Major surgical procedures should be completed under anesthesia that will render the animal insensitive to pain. Muscle relaxants and paralytics have no anesthetic action and must not be used as a substitute for anesthesia. Postoperative care must include efforts to minimize discomfort and the risk of infection.

Some studies require surgical preparation of animals that are not intended to survive. In such cases the animals ordinarily should be maintained unconscious throughout the experiment. At the end of the experiment animals must be euthanized without recovering consciousness.

Where experiments require physical restraint and/or the withholding of food or water, the effects of which are not themselves the objects of study, care must be taken to minimize discomfort or distress and to ensure that good general health is maintained. Only when there is no alternative procedure should animals be subjected to immobilization or restraint to which they cannot be adapted readily. Whenever it is not inconsistent with good experimental design, the experimental schedule should include reasonable periods of rest and readjustment. In the rare cases where distress and discomfort are unavoidable attributes of a well-designed study, the investigator must, within the limits of the design, take all possible steps to minimize these effects and to minimize the duration of the procedure and the number of animals used.

ARVO will amend The Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research pending changes to US and EU guidelines (FELASA and EU legislation).

後固定

前固定した試料組織をHEPESまたはカコジル酸緩衝液で5分ずつ2回洗浄する。
前項で紹介した後固定液(1%オスミウムを含むHEPESまたはカコジル酸緩衝液)を試料組織が完全にかぶる程度入れる。
固定時間は1時間。数分でサンプル組織は黒化してくるはずである。
後固定液の作製に用いた緩衝液(HEPESまたはカコジル酸緩衝液)で1回5分間洗浄し、その後1分間蒸留水で洗浄後脱水過程に移る。
ここで言う洗浄は溶液の置換によって行うが、厳密ではなく、中の試料が落ちないようにサンプル瓶を傾けて溶液を流し出し、新しい溶液を入れればいい(図7)。

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