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Hitachi

株式会社 日立ハイテクノロジーズ

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(2) 接着による細胞膜剥離

準備するもの:

  • Alcian Blue塗布カバーグラス(2.5mm×2.5mm)
  • 溶液
  • KHMgE緩衝液
  • HEPES ベースの哺乳類リンゲル液(+Ca)

アルシアンブルー塗布カバーガラスの作り方

  1. シャーレに濾紙を敷き、その上に2.5mm×2.5mmのカバーガラスを必要な分だけ置く(普通15~20枚)。
  2. カバーガラスをプラズマコーターでイオンクリーニングし親水化する。親水化はAlcian Blue水溶液を載せやすくするために行うので、必須ではない。
  3. 1% Alcian Blue水溶液カバーガラスの上に載せ、約1分間処理する。
    (なお、接着性を高めるには高分子量(70,000以上)のPoly-L-lysineなども使用できるが、Alcian Blueの形状が小さいので使用している。)
  4. 蒸留水でAlcian Blueを洗い流し、乾燥させてから使用する。ガラス表面がほんの僅か青みがかる程度が良い。接着性は時間と共に劣化するので2日間以内に使用する。

膜剥離のプロトコール

  1. シャーレで細胞を培養する(底面の8~9割を占めるぐらいまで増殖させる)。
  2. 培養液を除き、37℃まで暖めたHEPES ベースの哺乳類リンゲル液(+Ca)で一回洗浄する。
  3. リンゲル液を捨て、あらかじめアルシアンブルー溶液で接着性を高めたカバーガラスを細胞の上に載せる。
  4. 10~20秒後、固定をしないのであれば、ピンセットでカバーガラスの端を掴み引き上げるか、KHMgE緩衝液を端から注ぎカバーガラスを浮かせることで、背側の膜を採取することが出来る(図5を参照)。
    直ぐに急速凍結できない場合、あるいは免疫標識を行う場合は0.1~0.5% glutaraldehyde 、2% paraformaldehydeを含むKHMgE緩衝液を端から注ぐ。カバーガラスはapical側の膜を接着したまま浮き上がる。固定液は接着効果を強くするので収量がよくなる。

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