如“和吸光光度法的区别是什么”及“荧光分光光度法的缺点”中所述，样品数据和光谱形状会随系统变化而发生改变。如果使用同一个系统型号，则同一的光谱形状保持相同，不同实验次数间的数据也会不同。这是由于每种型号光路系统的特性。在光谱校正中，提前测量仪器或系统特性，并将其用于数据处理中。
日立的一些荧光分光光度计能够通过测量标准品获得仪漂数。在这种情况下，校正激发侧时，标准品是罗丹明B。校正荧光侧时，使用扩散素子，通过选配副标准光源还可以校正荧光侧的长波长区域。
通过扫描激发波长得到激发光谱，扫描荧光波长获得荧光光谱。图11左图显示的是反复测量荧光光谱的同时改变激发波长得到的许多光谱，图11右侧为左侧图的等高线图。这样的三维荧光光谱包含数十个荧光和激发光谱的信息，可以方便的表达大量信息。
图11 三维测量
细胞内钙离子浓度可以使用荧光分析法进行测定。在连续施加几个波长条件的同时测量输出时间的变化，从而可以计算浓度。
图12 钙离子浓度测量
在一般的荧光分光光度计中，激发光连续照射样品。 如果用脉冲（即闪光）照射，荧光将在数十纳秒（1 ns = 10-9 s）的数量级内消失，留下磷光，其持续闪烁数毫秒至数秒。
在某些型号的荧光光度计中，连续的激发光可能会通过斩波器转换成脉冲光，从而可以测量样品的磷光成分。
图13 磷光测量
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