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1.1 你什么时候是兴奋的?(激发光谱)

请给以下场景中你的兴奋度打分
坐过山车
穿越山间隧道
体育场观看足球比赛
假设A、B、C三人兴奋度的得分情况如下:

表1 A、B、C三人在不同场景下的兴奋度得分
表1  A、B、C三人在不同场景下的兴奋度得分

上述表格直观表明了三个人在不同场景下的兴奋程度。
一般情况下,人在接受外界刺激后会产生兴奋,但不同的人对不同刺激的响应程度不同,其他人可以通过观察受刺激人的兴奋程度来判断其性格。
那么如何判断一个人是兴奋的呢?答案很简单,观察一个人兴奋时的不同现象,如心跳加速、出汗、脸红、大哭、大叫。只要观察到其中任何一个现象就可以判定这个人是兴奋的。
现在,让我们回到实际的荧光分光光度计。样品受荧光分光光度计的刺激而兴奋,不同的样品或材料能够承受的刺激不同,处于兴奋的样品会呈现不同的现象以说明它们是兴奋的。比如,它们会发出光,如果它们发出的光强烈,说明它们兴奋的程度大。如果它们发出的光弱,说明它们兴奋的程度小。
那么,刺激样品兴奋的来源是什么?在荧光光度法中,光辐射被看作是刺激样品的手段,通过改变辐射光的波长给样品施加不同的刺激。
基于以上知识,使用开篇的方式为不同场景下的兴奋度打分。
请为样品在以下场景的兴奋程度打分。
暴露于紫光
暴露于蓝光
暴露于绿光

表2 A、B、C三人在不同场景下的兴奋度得分
表2  A、B、C三人在不同场景下的兴奋度得分

表2直观的显示了样品A、B、C的兴奋程度
通常来说,使用荧光分光光度法分析的样品在暴露于光时,被激发产生光。一般不同的样品会受到不同波长的光激发,因此我们可以通过观察样品在不同波长光照下产生的光来判定样品的性质。
另外,我们做出以下定义:
样品被刺激的状态——激发态
用来刺激样品的光------激发光
样品受刺激后的发射------荧光
兴奋度的得分------激发光谱
通过我们的眼睛,仅仅可以依靠波长的颜色辨别激发光,如紫色、蓝色和绿色。在荧光分光光度计和光谱分析中,这些光的颜色依靠波长来辨别(单位nm)。紫色: 400 - 420 nm、蓝色: 450 - 500 nm、绿色: 500 - 550 nm。通常激发光谱的形状如图1所示。

图1 激发光谱
图1 激发光谱

1.2 兴奋之后会发生什么?

如之前所说,我们仅通过一种现象就可以确认一个人发生了兴奋,接下来我们详细讨论下样品兴奋时的关键特征。
假设A、B、C三人是兴奋的,为以下兴奋现象分别打分。
出汗
脸红
心跳加速
A、 B和C 的得分如表3所示。

表3 A、B、C的得分表
表3 A、B、C的得分表

表3的结果可以表明A、B、C三者的特征。
受激发的样品发射光的颜色可以说明样品的特征。通过观察被激发样品的发射光颜色,可以作为了解样品特征的线索。表格中的结果被称为荧光光谱,
下图即为通常荧光光谱的形状。

图2荧光光谱
图2荧光光谱

图2表示当这个样品被激发时,在500 nm处发射出最强的荧光,在450 nm处发出较少的荧光。本文附录有更详细的测量案例。

1.3 假设存在很多人类克隆体,该怎么办?(定量分析)

这部分设想来源于科幻小说,假设人类克隆体是可能的,我们设定100个人类克隆体,他们在发生兴奋时会无意识的大叫。
那么当将这100个人放在同一个房间时,通过刺激让他们兴奋时会发生什么?假设他们都是完美的克隆体,则房间里回响的尖叫声是一个人尖叫声的100倍。因此若已知一个人的尖叫声,那么通过测量一个房间内未知人数总的喧哗量,则可以计算出这个房间的人数。
使用荧光分光光度计测量样本浓度的定量分析与此类似。如果样品具有相同的成分,只是浓度不同,则浓度大的相当于人很多尖叫大,浓度小的相当于人很少尖叫小。

图3 100个人的喧哗量
图3 100个人的喧哗量

如图,通过测量一组已知浓度的样品荧光强度,绘制样品的校准曲线。测量未知浓度样品的荧光强度,利用绘制好的校准曲线,可以在校准曲线上确认该样品的浓度。比如,假设这个样品的荧光强度是40,通过查阅上述校准曲线,确定样品的浓度约为16 ppm。

表4 标准样品的浓度和荧光强度
表4 标准样品的浓度和荧光强度

图4 样品的校准曲线
图4 样品的校准曲线

那么荧光分光光度法可以实际测量的浓度范围是多少?
根据以上描述的理论,似乎对于测量浓度很大的样品也是可能的,其实这并不正确。如果样品浓度太大,从样品池某个部位发出的荧光很可能被它周围物质吸收(这将使激发光谱或荧光光谱变形)或者是激发光无法完全到达样品池内部,导致荧光减少。当然,如果样品浓度太低,荧光太弱也无法检测到。这两种情况下,能够测量的浓度范围很大程度上取决于被测物体。

图5 荧光现象
图5 荧光现象

1.4 和吸光光度法的区别是什么?

1.4.1 测量的波长

两种方法分别是使用紫外分光光度计和荧光分光光度计,利用不同波长的光照射样品执行测量。这样看来,吸光光度法和荧光分光光度法在仪器组成上非常相似,另外,测量数据的横坐标皆为波长也是相似的。然而,两者在测量方法上有一个很大的差别。
吸光光度法测量照射的光被样品吸收了多少。因为照射的光,除了被样品吸收的部分,其他都会经过样品,因此通过测量经过样品的光即可以估算样品的吸光度。
请注意,在观察光的波长和照射光的波长相同的情况下,会观察到照射光减少。但是在荧光分光光度法中,观察到的光和照射的光有不同的波长。

图6 吸光光度法示意图
图6 吸光光度法示意图

图7 荧光光度法示意图
图7 荧光光度法示意图

现在让我们更仔细的考虑这个问题。 一个光子的波长和能量之间有以下关系:

在荧光光度法中,激发光的能量被吸收,然后转化为不同形式的光,即荧光。但是一些能量在转换过程中发生损失。因此,不是所有的激发光都能转换为荧光,
因此荧光的波长总是大于激发光的波长,即斯托克斯定律。
在图7中,荧光可以在激发光的垂直方向检测到。如果像吸光光度法一样,在照射光通过的地方检测荧光,则照射的激发光也会被检测到。如前面所说,在荧光光度法中,我们需要检测的是荧光而不是激发光,因此,不希望激发光进入检测系统。
因此,在垂直方向上检测荧光,能够检测到最少的激发光。尽管如此,由于各种不规则反射光,一些激发光也会进入检测系统,产生散射光。

1.4.2 高灵敏度

比较吸光光度法和荧光光度法的定量分析,若将吸光光度法测量的样品稀释至1/1000,仍可以用荧光光度法测定。因此荧光光度法的检测限通常比吸光光度法低三个数量级。
为什么是这样?
观察以下图形,可以看出吸光光度法在高浓度样品下和空白样品的条形图差异更明显,但是在荧光光度法可以区分出浓度更低的样品差异。荧光光度法有利于测试低浓度样品。

图8 吸光光度法和荧光光度法
图8 吸光光度法和荧光光度法

理论上如下。
让我们考虑一个透射率为99%的稀释样品。尽管任何测量都伴随有误差,但在这种情况下,我们假定其为0.1%。在正常的吸光光度法中,与空白(浓度为0)相比,测量的是透射光的量。误差因子以相同的比率影响空白和样品。

由于浓度测量中的误差为0.2%,而透射率的差为1.0%,则其误差将为20%。 另一方面,由于在荧光分析法中与空白的差异通常对应于样品的浓度。

荧光分析法在较低浓度下非常有利,因为百分比误差不取决于样品的浓度。 在吸光光度法中,图8中箭头所示的浓度信息(空白样品和样品的透射率之间的差异)变得与噪声水平相当的点是检测极限(此处为0.2%)。
在荧光光度法中,荧光量本身是荧光分析法中的浓度信息(不是吸光度法中的差异),因此如果样品发出荧光,则可以通过放大电信号来检测。

表5 荧光光度法和吸光光度法检测限的比较表
表5 荧光光度法和吸光光度法检测限的比较表
注:检测限定义为某点荧光信号是背景信号的两倍时。

1.4.3 丰富的信息

在荧光光度法中,有两种波长:激发波长和荧光波长。因此在光谱测量中,有两种光谱:激发光谱和荧光光谱。在吸光光度法中,仅有一种吸收光谱。对同一个样品来说,荧光光度法能够提供比吸光光度法更多的信息。
另外,激发光谱被用来确定产生荧光的最有效的激发波长。通过吸收激发光的能量来产生荧光,因此,若吸收更多,则产生的荧光就更多。可以证明激发光谱与吸收光谱相似。

1.4.4 组分确定

假设一个样品里混合了A和B两种组分,如果它们的吸收波长几乎相同,那么使用吸光光度法,则无法区分它们。然而,在荧光光度法中,如果荧光波长是不同的,即使吸收波长相同,也可以很容易辨别有几种组分。

1.4.5 荧光分光光度法的缺点

根据对荧光光度法的描述,似乎相比于吸光光度法,荧光光度法是个很好的分析方法。然而荧光光度法也有一些缺点:

  1. 大多数天然材料即使在暴露于不同波长的激发光下时,也不发荧光。因此,相比于吸光光度法,可以测量的成分非常有限。对于不发荧光的材料,通常需要在预处理后,进行荧光测量,但是预处理往往比较复杂。
  2. 吸光光度法的测量结果是普遍的,原则上,任何仪器制造商都可以提供同样的值。然而,在荧光光度法中,荧光强度是一个无量纲的相对值。比如说,即使是同一制造商的同一型号仪器由于检测器等个体差异也有可能得出不同的结果。即使测定同一个样品,发光强度也是不同的,即50或100。当然,其他仪器制造商也是如此。

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