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2.1 基本原理

以下流程图表示一般的荧光分光光度计。
激发光源是一个为样品提供照射光的光源,一般使用氙灯。

图9 一般荧光光度计的组成
图9 一般荧光光度计的组成

由激发光源发出的白光进入激发侧单色器,测定激发光谱(吸收光谱)时,改变激发光的波长,测定荧光强度对应的变化,测定荧光光谱时,激发波长固定,测量荧光强度随发射波长的变化。
来自激发侧单色器的光照向样品,沿着这个路径,半透半反镜会将光束分离,一部分光到达监控检测器,监控检测器用来监控激发光到达样品的强度,检测器通常使用光电管、光电二级管、光电倍增管等。当激发光到达样品时,样品被激发以发出荧光,发出的荧光进入荧光侧单色器。
在测量激发光谱时,荧光侧单色器选择特定的波长固定。当测量荧光光谱时,荧光侧单色器通过移动以测量发射波长。
离开荧光侧单色器的荧光会进入荧光检测器(5),通常是光电倍增管,荧光检测器会将荧光转换为模拟电信号,再经过A/D转换电路(6)转换为数字信号,通过计算机(7)控制波长扫描和信号处理。

2.2 使用的组件

以下是荧光光度计的光路系统图。

图9 一般荧光光度计的组成
图10 光路系统组件图

2.3 性能比较时的注意事项

仪器系统的性能指标在其目录最后一页有描述,在这里介绍术语的含义和如何读取这些数字。

  1. 灵敏度:使用者最在乎的一个指标。这是来表明如何获得噪声小且数据平滑的指标,该指标越大,系统越好。它也被称为信噪比。但是,灵敏度的测量条件不同,这个指标的数字也不同。若测量条件不一致,如狭缝、响应(时间常量)等,则无法进行不同系统的比较。一些制造商在有利条件下测试灵敏度,将其展示在仪器 手册中。
  2. 光源:除个别案例外,仪器制造商一般使用150W氙灯作为光源。无臭氧灯在波长小于220 nm处提供很弱的光,若使用小于220 nm的波长作为激发光则是不可能的。
  3. 波长范围:测量波长越宽,应用越广。
  4. 狭缝:也称为带宽,它代表在光度计入口和出口处狭缝的宽度。如果狭缝宽度大,则由于光量增加而可以获得具有相对较低噪声(灵敏度高)的数据,但是,无法确定光谱的细微峰值。如果狭缝很窄,则可以确定光谱的细微峰值,但是光量会减少,从而导致数据噪声增加。虽然最终结果主要取决于样品,但是考虑到荧光分光光度计对微量样品分析的灵敏度,没必要缩小狭缝宽度。
  5. 响应:如果响应较大,光谱就变得比较平滑,但是光谱形状会变钝。当测量激发、发射光谱时,应该依据扫描速度选择最佳的响应。在一定扫描速度下,如果没有选择合适的响应,即使响应比较小,也有可能增加噪声,使光谱变形。
  6. 其他:如三维光谱测量,磷光测量等特殊的测量,可以通过选配软件来实现。一些仪器型号的标准配置也可执行这些测量。

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