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Hitachi

株式会社 日立ハイテクノロジーズ

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(2) 低角度回転蒸着法(low angle rotary shadowing)

単離精製した蛋白質分子や核酸、あるいはそれらの複合体を観察するには前述のネガティブ染色法のほかに白金蒸着による方法がある。
白金を蒸着するのでネガティブ染色にくらべコントラストが高く、容易に分子の形やおおまかな立体構造を掴むことができる。ただ、対象となる試料は小さいので高角度からの蒸着では埋もれてしまい、観察することはできない。そのため、水平に対し2~5度という極めて低い角度で蒸着し、分子を埋もれさせるのではなく、その形を強調するように修飾する。これがこの方法の名前の由来である。
分解能は白金蒸着分だけネガティブ染色より劣る。しかし、電子線による照射損傷を気にせず、比較的簡単な手順で分子の形を明瞭に観察できるのは大変価値がある。この方法のキーポイントは不純物を纏わず試料分子だけを水平な基質(通常マイカ劈開面)の上に載せることである。
ここではこのための試料処理として、最も一般的なグリセリン法とマイカフレーク法を紹介する。前者に比べ後者の方が優れているが、手間と急速凍結装置などの設備が必要になる。また、マイカフレーク法はフリーズエッチングレプリカから派生した方法であるので低角度回転蒸着法とは別に独立した方法として記載される場合が多い。ここでも一つの独立した方法として扱う。

グリセリン法

50%グリセリン溶液に精製した蛋白質を混ぜ、絵書き用のエアブラシでマイカ劈開面に噴霧する。エアブラシ先端からマイカ面までの距離は約40cmであるが厳密ではない(図1参照)。
空気圧を上げれば試料を含んだ霧は遠くまで届くが、試料の機械的損傷を招きかねない。また、近づきすぎると空気圧は減少できるが、霧の粒の密度が上がりマイカ面上で融合し、大きくなるため、グリセリン溶液から試料分子の遊離が不完全になることが多い。
グリセリンを用いることにより不純物を纏わず分子をマイカ上に展開できる理由はその表面張力にある。図2に書いたように試料分子を含んだグリセリン水滴は真空中に持ち込まれると急速に収縮する。最初の収縮においてグリセリン水滴は表面張力により球形を保ったまま収縮する。この時水滴に含まれる試料分子のうちの一部がマイカ面上に取り残される。この取り残された分子を白金蒸着で強調修飾し観察するわけである。
また、マイカ面上に取り残される時、分子に纏わりついているものが(グリセリンの大半も)取り払われる。すなわち、50%グリセリン溶液は噴霧するときは試料分子を保護し、急激に真空中に持ち込んだ時は中心に向かい張力を保ったまま収縮するので、試料をマイカ面上に遊離させる作用がある。
このようにグリセリンの物性を利用する方法であるため、リン酸緩衝液のようにグリセリンと反応し表面張力を減少させる物質は試料分子の溶媒として使用できない。グリセリンの表面張力が落ちると収縮がうまくいかず、図3に示すように試料分子に多くのグリセリンが纏わりつき形の一部しか観察できない。蛋白質分子を精製過程で用いた物質が残存するのもあまり好ましくない。また、真空中でのグリセリン滴の収縮において、試料分子とグリセリンの間に張力が発生するので、これにより分子の形が変化し、破損することも考えられる。像の解釈には十分注意を払う必要がある。

実際の手順
準備するもの:

  • 試料噴霧装置
    (図1参照;トータルとしての市販品はないのでエアブラシを購入し、窒素ガスボンベと繋げるなどして自作する)
  • 蒸着装置
    (2~5度の蒸着角度がとれるもの、フリーズエッチング装置が最適であるが、室温で蒸着するため工夫すれば普通の真空蒸着装置も使用できる)
  • グリセリン
  • 蒸留水
  • 膜張メッシュ
  • ピンセット

作製手順:

  1. グリセリン溶液に試料を懸濁し、全体で50%グリセリン溶液とする。
    1回の実験に使用する量は40µLであるので80µLも作れば十分である。濃度は2µg/mL以上が望ましい。
  2. マイカを7mm×7mm程度の大きさに切る。使用直前にピンセットでマイカを二つに劈開する。図1のように劈開面をエアブラシ側に向け、両面テープで端を軽くとめる。
    (マイカ全面を接着すると試料噴霧後に剥がすのに苦労するのでほんの一部だけ接着する)
  3. エアブラシの絵の具を投入する場所(エアブラシの上部にラッパ上に開口している部分)に試料溶液約40µLを注ぎ、ほぼ同時に窒素ガス導入のトリガーを引き噴霧する。噴霧は瞬間的(2秒以内)に1回おこなう。
  4. 噴霧後マイカを取り外し直ちに蒸着装置の試料台に取り付け、真空にする(30秒以内)。我々は日立フリーズエッチング装置 FR-9000を用いているので、試料台を載せるステージに直接両面テープを張り、そこにマイカを固定し、装置に持ち込む。
  5. 白金は試料面に対し2.5度で蒸着する。EBガンによる電子線蒸着では約1分間かけて通常のフリーズエッチングレプリカを作製するときと比べ、ほぼ4倍量ぐらい蒸着する。
    それでも低角度のため大半が通り抜け、マイカ面上にはそれほど堆積せず、試料分子の形が強調される。
  6. 白金蒸着の後、炭素を補強のため高角度から蒸着する。我々は試料面に対し90度で蒸着している。
  7. 蒸着後マイカを大気中に取り出し、図のように蒸留水に斜めに徐々に浸けて、蒸着膜をマイカ面から水面上に剥離する。これをグリッドメッシュで回収し、透過電子顕微鏡で観察する。

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