伊藤正人*1，成松郁子*1，裴敏伶*1，森崎敦己*1，铃木裕志*2，福田真人*1，八木隆*1，大月繁夫*1，关一也*1，丰崎耕作*1
1958年，D.H.Spackman，W.H.Stein和S.Moore发明了离子交换分离、茚三酮柱后衍生氨基酸技术，使得氨基酸分析选择性高、分析速度快、准确度高。而且成功实现了自动化，是研究的重要里程碑。自此，氨基酸分析仪被广泛应用到饲料、药物、食物等的氨基酸及其类似物的分析中。
日立从1962年开始潜心研究氨基酸分析仪，并在技术上取得了巨大的进步（图1）。
图1 日立氨基酸分析仪的发展史
LA8080全自动氨基酸分析仪采用离子交换色谱分离和茚三酮柱后衍生技术，是分析氨基酸的专用仪，主要有以下三大特点（图2）。
图2 LA8080全自动氨基酸分析仪外观
LA8080色谱柱填充了强酸性阳离子交换树脂，缓冲液有钠盐型和锂盐型两种，并可常温保存反应液。LA8080有6种缓冲液，无论您使用哪种分析方法，都可使用等度法或梯度法轻松完成多成分的精准分离。
图3所示为氨基酸分析仪的流路结构图。切换电磁阀自动鼓入氮气，缓冲液和衍生液分别通过泵1和泵2被输送。为减小基线噪音，LA8080采用微量泵，降低了液体脉冲（压力变化）。
自动进样器可放置120个1.5mL的样品瓶。含天门冬酰胺（AspNH2）和谷氨酰胺（GluNH2）的样品需要低温保存， 可配LA8080温控样品盘。
柱温箱采用帕尔帖元件，确保柱温箱温控精度。衍生化反应前，将茚三酮试剂和缓冲液混合。从色谱柱分离出的氨基酸成分，经泵2与茚三酮混合，并在反应单元中加热至135℃。为了减小混合液流动过程中谱峰加宽效应，进一步提高衍生效率，LA8080衍生部分采用TDE3反应器。
多数氨基酸与茚三酮的衍生产物最大吸收波长是570nm，脯氨酸和羟脯氨酸的衍生产物最大吸收波长是440nm，可根据吸光度测定氨基酸的含量。为了保证分析准确度，使用700nm的可见光来补偿卤钨灯的光源波动。
分析数据系统软件使用OpenLAB CDS Ver.2，可实现统一控制、数据管理、定性和定量分析，有效简化工作流程。
图3 LA8080的流路图与内部结构
图4所示为通过标准分析法来分析蛋白质水解液的色谱图。以0.40mL/min流速输送柠檬酸钠缓冲液，使粒径为3μm的阳离子交换树脂色谱柱（i.d.4.6mm×60mm）保持57℃。然后，以0.35mL/min流速输送茚三酮试剂与缓冲液混合，135℃时衍生，在570nm和440nm的波长处测量吸光度。
分析30分钟后，各成分分离度达到1.2以上。另外，天门冬氨酸（Asp）的检出限为2.5 pmol以下（信噪比=2），峰面积重现性（2 nmol）良好，RSD低于1.0％。
图4 蛋白质水解分析实例
在做蛋白质成分分析时，一般我们使用盐酸来水解蛋白，但是半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸很容易被氧化。因此，目前在分析磺丙氨酸（CySO3H）和蛋氨酸砜（MetSON）时，先用过甲酸氧化，然后再加盐酸水解。如图5所示为仅分析CySO3H和MetSON的短程序分析应用实例。
图5 过甲酸氧化水解和短程序分析实例
Moore等人发明的氨基酸分析方法能够一直沿用至今，是因为他们在设计分离系统和衍生系统时，经过反复斟酌，精心设计。聚苯乙烯聚合物的离子交换树脂与氨基酸的相互作用十分巧妙，芳香族的中性氨基酸如苯丙氨酸和酪氨酸，增强了与色谱柱填料聚合物之间的疏水相互作用，从而实现了良好的分离。茚三酮的柱后衍生方法对样品中的杂质有较高的选择性，用户只需认真完成去蛋白以及过滤处理，即可获得高可靠性的分析结果。
“前人栽树，后人乘凉”，我十分惊叹于前人的智慧并满怀感激，今后我们会将氨基酸分析技术在日立发扬光大。
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