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日立高新技术在中国

伊藤正人*1,成松郁子*1,裴敏伶*1,森崎敦己*1,铃木裕志*2,福田真人*1,八木隆*1,大月繁夫*1,关一也*1,丰崎耕作*1

1. 前言

 1958年,D.H.Spackman,W.H.Stein和S.Moore发明了离子交换分离、茚三酮柱后衍生氨基酸技术,使得氨基酸分析选择性高、分析速度快、准确度高。而且成功实现了自动化,是研究的重要里程碑。自此,氨基酸分析仪被广泛应用到饲料、药物、食物等的氨基酸及其类似物的分析中。
 日立从1962年开始潜心研究氨基酸分析仪,并在技术上取得了巨大的进步(图1)。

图1  日立氨基酸分析仪的发展史
图1 日立氨基酸分析仪的发展史

2. 产品特点

 LA8080全自动氨基酸分析仪采用离子交换色谱分离和茚三酮柱后衍生技术,是分析氨基酸的专用仪,主要有以下三大特点(图2)。

  1. Comfortable:操作简便
    设计符合人体工学,充分考虑到用户的视野范围和操作流程。衍生化反应前才将两种溶液进行实时混合,因此茚三酮溶剂无需冷藏。可直接使用市售的缓冲液和衍生溶剂。
  2. Compact:设计紧凑
    日立首次采用台式设计。占地空间小,主机体积缩小了约30%。前置设计综合考虑了多种因素,方便放试剂瓶和样品,更换色谱柱和密封配件也十分简便。
  3. Reliable:数据可靠性高
    秉承了之前型号“L-8900”“L-8800”的优异性能,采用离子交换色谱法,基本分析条件和之前型号一样。茚三酮柱后衍生反应的稳定性高,因此可在蛋白水解和生理体液分析法中获得良好的定量分析数据。

图2  LA8080全自动氨基酸分析仪外观
图2 LA8080全自动氨基酸分析仪外观

3. 产品介绍

 LA8080色谱柱填充了强酸性阳离子交换树脂,缓冲液有钠盐型和锂盐型两种,并可常温保存反应液。LA8080有6种缓冲液,无论您使用哪种分析方法,都可使用等度法或梯度法轻松完成多成分的精准分离。
 图3所示为氨基酸分析仪的流路结构图。切换电磁阀自动鼓入氮气,缓冲液和衍生液分别通过泵1和泵2被输送。为减小基线噪音,LA8080采用微量泵,降低了液体脉冲(压力变化)。
 自动进样器可放置120个1.5mL的样品瓶。含天门冬酰胺(AspNH2)和谷氨酰胺(GluNH2)的样品需要低温保存, 可配LA8080温控样品盘。
 柱温箱采用帕尔帖元件,确保柱温箱温控精度。衍生化反应前,将茚三酮试剂和缓冲液混合。从色谱柱分离出的氨基酸成分,经泵2与茚三酮混合,并在反应单元中加热至135℃。为了减小混合液流动过程中谱峰加宽效应,进一步提高衍生效率,LA8080衍生部分采用TDE3反应器。
 多数氨基酸与茚三酮的衍生产物最大吸收波长是570nm,脯氨酸和羟脯氨酸的衍生产物最大吸收波长是440nm,可根据吸光度测定氨基酸的含量。为了保证分析准确度,使用700nm的可见光来补偿卤钨灯的光源波动。
 分析数据系统软件使用OpenLAB CDS Ver.2,可实现统一控制、数据管理、定性和定量分析,有效简化工作流程。

图3  LA8080的流路图与内部结构
图3 LA8080的流路图与内部结构

4. 应用

 图4所示为通过标准分析法来分析蛋白质水解液的色谱图。以0.40mL/min流速输送柠檬酸钠缓冲液,使粒径为3μm的阳离子交换树脂色谱柱(i.d.4.6mm×60mm)保持57℃。然后,以0.35mL/min流速输送茚三酮试剂与缓冲液混合,135℃时衍生,在570nm和440nm的波长处测量吸光度。
 分析30分钟后,各成分分离度达到1.2以上。另外,天门冬氨酸(Asp)的检出限为2.5 pmol以下(信噪比=2),峰面积重现性(2 nmol)良好,RSD低于1.0%。

图4  蛋白质水解分析实例
图4 蛋白质水解分析实例

 在做蛋白质成分分析时,一般我们使用盐酸来水解蛋白,但是半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸很容易被氧化。因此,目前在分析磺丙氨酸(CySO3H)和蛋氨酸砜(MetSON)时,先用过甲酸氧化,然后再加盐酸水解。如图5所示为仅分析CySO3H和MetSON的短程序分析应用实例。

图5  过甲酸氧化水解和短程序分析实例
图5 过甲酸氧化水解和短程序分析实例

5. 总结

 Moore等人发明的氨基酸分析方法能够一直沿用至今,是因为他们在设计分离系统和衍生系统时,经过反复斟酌,精心设计。聚苯乙烯聚合物的离子交换树脂与氨基酸的相互作用十分巧妙,芳香族的中性氨基酸如苯丙氨酸和酪氨酸,增强了与色谱柱填料聚合物之间的疏水相互作用,从而实现了良好的分离。茚三酮的柱后衍生方法对样品中的杂质有较高的选择性,用户只需认真完成去蛋白以及过滤处理,即可获得高可靠性的分析结果。
 “前人栽树,后人乘凉”,我十分惊叹于前人的智慧并满怀感激,今后我们会将氨基酸分析技术在日立发扬光大。

撰写人

*1
伊藤正人,成松郁子,裴敏伶,森崎敦己,福田真人,八木隆,大月繁夫,关一也,丰崎耕作
日立高新科学公司 产品统括本部 开发设计本部 光学设计部
*2
铃木裕志
日立高新科学公司 营业本部 应用技术部