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日立高新技术在中国

透射电镜带您解读生命学难题

~弘扬One for All精神,推动基础研究,促进临床应用~

《SI NEWS》第58-1刊中,刊载了泽口朗教授撰写的“操作简单、高清晰成像!取得巨大进步的新一代生物医学透射电镜分析”,为读者介绍了透射电子显微镜在细胞内部微细结构观察上的优异性能和分析方法。
泽口教授负责iPS细胞前沿研究的部分项目,为了解他私下真实的一面,我特地前往位于宫崎大学清武校内的实验室。

宫崎大学医学部 解剖学讲座 超微形态科学领域 教授
宫崎大学前沿科学实验综合中心 生物成像实验室 主任
泽口 朗(医学博士)

泽口 朗(医学博士)

放弃“怪医黑杰克”的手术刀,专注于电镜分析

泽口朗教授从小就对人体结构有着浓厚的兴趣。他对事物充满了好奇心,总有问不完的问题:“为什么会发烧?”“为什么会咳嗽?”……母亲当过护士,但他对母亲的回答并不满意。所以他经常自己去查百科全书,而且他不看“昆虫”“交通工具”之类的,总是翻看“医学”卷。小学1年级的时候,他最爱看手冢治虫的“怪医黑杰克”,梦想有一天自己也能成为外科医生。高中时期他迷上了橄榄球。1990年毕业于宫崎医科大学(2003年与宫崎大学合并为宫崎大学医学部)。泽口教授沉浸在“可以真正学习人体学”的喜悦中。但随后,他便深刻体会到“用科研成果回馈社会”的个人理想,与临床现实之间的差距。
泽口教授的办公桌上一直放着一封信。那是他从医学系毕业后,在顺天堂大学实习时,一位男癌症患者写给他的。这也是他没有从事临床医学,选择科研的重要原因之一。经过一系列检查,等待着诊断结果的那个男人,在被告知为肝癌时,原本宛如布匹店老板的凛然姿态一下子退却了,扶着输液架的手也开始颤抖起来。
“当被告知‘只剩下半年的生命’时,从他的眼里,我似乎看到‘医生,刚刚我被告知只能活半年,那您能帮我延长一点儿吗?1个月、2个月也行。’”但是我却什么都做不了。甚至我觉得我没有权利宣布别人的生命期限,一个25,6岁的黄毛小子有什么权利对56岁的长者说这些话呢?因此,我下定决心做科研。”
现实中有很多尚未确定治疗方法的疾病,医生有权利忽视这些,直接宣布患者生命的剩余时间吗?专科医生能研究出新的治疗方法吗?带着这些尖锐的问题,泽口教授在顺天堂大学实习了1年,还到解剖学第二讲座登门求教,讲座是他大学好友,宫崎医科大学研究生学院的菅沼龙夫(现宫崎大学学长)主办的。医学的基础是主宰生命功能的形态学和洞悉结构的解剖学,一切研究都应不违背初心。
泽口教授如是说道,“于是我选择用电镜直接观察病灶,这比起只看数据更加直观,更有说服力”。因此他放弃了手术刀,专注于电镜分析,以推动“超微形态科学”的研究,使胃粘膜的微细结构一览无遗。

泽口教授的办公

鲜活的细胞形态,魅力四射

泽口教授在研究生时期,初次接触“高压冷冻方法”。这是一种样品制备的新方法,主要用于形态观察和组织化学分析。观察此方法制备的样品时,他被所看到的图像深深吸引。
“高压冷冻完全不同于以前的制样方法。第一次用这种方式观察样品时,我就觉得太漂亮了。以前的化学固定法是利用化学固定剂固定与蛋白质有关的物质,生物样品(线粒体)容易出现样品扭曲、收缩,但是采用高压冷冻方法处理的细胞样品十分饱满,‘完全呈现出鲜活的细胞形态’。但凡你用这种方法观察一次线粒体,就不会想用化学固定法了。所以,我想做这个课题研究。全力以赴,取得更多的科研成果,这也是我来这里的原因。”

利用高压冷冻方法获得的观察图像

初代培养兔子胃底腺壁细胞中的线粒体

在标准大气压下,快速冷冻生物样品会产生冰晶,细胞内结构呈零碎状态。依据物理原理,样品会在2,100 bar高压下瞬间冷冻,由此可抑制冰晶的形成,而且不会损伤细胞的原有形态,使我们观察到美丽的样品形貌。瑞士的实验室成功研发出国内第二台高压冷冻装置BALTECHPM010,并投放市场销售。1994年生物成像实验室采购了这台仪器,但是高投入并没有取得显著的成果。菅沼校长建议道:“泽口,反正有新仪器,你能用它研究出点什么吗?”当听到液氮瓶发出的危险噪音时,几个带着安全帽的同事纷纷向后退,而他却丝毫未受影响,果敢的继续实验。泽口教授通过反复实验和不断创新,将直径3mm,厚度300μm的样品台重新设计,使它可以放置小老鼠胃粘膜,这对于高压冷冻方法的成功又迈了一大步。

遇见“向生命学挑战”的科研学者

泽口教授的研究生毕业论文题目为“高压冷冻方法—完好保持微观形态和生物体物质的新冷冻方法—的组织化学研究方向的应用”,在他临近毕业前,读了加利福尼亚大学伯克利校区(UC伯克利)分子细胞生物学部的John G Forte教授(已故)的论文,其中详细阐述了John G Forte教授如何利用高压冷冻方法发现了胃酸分泌机制。“我是一名使用高压冷冻法做胃粘膜研究的学者,请允许我到您那儿学习。”Forte教授收到这封邮件后,立刻回道“随时欢迎您的到来”。泽口教授在延期半年后,取得了博士学位,于2001年9月11日经过海关的严密检查,来到了美国。
在泽口教授看来,Forte教授是胃酸分泌研究的第一人,与临床专科医生的职责不同,他的作为才真正彰显了人类对于“生命学的挑战”。“他虽然不是医生,却发现了质子泵(胃酸分泌蛋白),并成功研制出质子泵抑制剂。使胃溃疡无需手术,通过药物治疗即可治愈。这里有医学研究的根基。不是医生的他,拯救了无数人的生命。”
当时,Forte教授实验室的电镜还不能观察到培养细胞分泌胃酸的状态。泽口教授勇于尝试高压冷冻方法,在铝制样品容器上培养细胞,这一实验具有划时代的意义。对每个样品容器进行高压冷冻、冷冻置换、树脂包埋处理,细胞切片制备完成后,通过电镜可成功捕捉到胃酸分泌的瞬间,图像十分清晰。这种可观察到培养细胞鲜活状态的创新方法,被很多论文争相引用。虽说UC伯克利校区有不少学者得过诺贝尔奖,但没有人做电镜分析,因此宫崎大学陆续接到了UC伯克利校区的电镜分析“订单”。泽口教授强烈地意识到高压冷冻方法的进步,所以决定回国发展。

胃酸刺激引起的细胞形态变化

胃酸刺激引起的细胞形态变化

一张电镜图直接影响iPS细胞的研究成果

电镜专家,求贤若渴。泽口教授认识到这也是国内正在面临的“严峻课题”。即使研究所有几十亿、几百亿的预算,没有客户,也是纸上谈兵。泽口教授采用引领世界的高压冷冻方法,运用日立透射电子显微镜HT7700,观察到高清晰的图像。随后东京大学医科学研究所和京都大学iPS细胞研究所也委托他进行样品观察和分析。
2014年,iPS细胞研究所成功开发出用iPS细胞大量且稳定形成血小板的方法,该研究论文曾发表于Top journal,血小板产出的决定性证据正是泽口教授用电镜记录下来的。
“为弘扬橄榄球运动员的One for All精神,我认为我们不但要认真搞科研,还要为社会贡献力量。iPS细胞属于国家级项目,比起自己做的研究,iPS细胞研究更为重要。”
如果可以用iPS细胞大规模安全生产血小板,它将成为血小板制剂的稳定供给源。长期以来,献血量一直不能满足临床需求,血液制剂的应用将为血小板减少症等特殊疑难杂症患者带去希望。“一名14岁的少女在微博上这样写道:‘我不能谈恋爱,也生不了宝宝。但是现在iPS细胞好像可以制造血小板。简直太棒了!’我忍不住要哭了。已经迫不及待地想要用了!”
为了加速iPS细胞研究的进程,我们不能一味地追求仪器的性能指标,更要注重样品制备法的改良和相关技术的提高。日立高新协助宫崎大学共同完成了“实时电镜图像通讯系统”的开发,进一步推动了由iPS细胞制造血小板的临床应用,预计此项研究将于两年后得到实际应用。通过联用视频会议系统,网格状界面可将电镜图像准确无误地实时共享给合作方,还可以互相讨论,据说这是看了日本象棋的电视转播,受到象棋盘网格的启发。

由人类iPS细胞诱导分化而成的巨核细胞中的血小板游离图像

由人类iPS细胞诱导分化而成的巨核细胞中的血小板游离图像

以“富士山脚下”为目标

据泽口教授所言,近两年以来,Top journal上以“自然”题材为主的论文中,电镜图像的刊载量呈上升趋势。科研前沿对于电镜分析的需求日益高涨,而电镜专家却在减少。比起当一个孤芳自赏的领跑者,泽口教授更愿意和其他学者一起并肩作战,而且他十分注重人才培养,不断拓展电镜的用户群。另外,“电镜研究支持系统EM-PAS”也是其中尤为关键的一环,这样就能放心的将需要一定经验才能完成的样品制备工作,交给宫崎大学前沿科学实验综合中心生物成像实验室。
“论精湛技术的重要性,我经常拿F1赛车和卡罗拉作比喻。F1赛车固然很关键,但是没有选手哪里有赛事!电子显微镜亦是如此,虽说分辨率和高电压很重要,但是只要能实现这些性能就可以了吗?当然不是,除了这些还要有能做简单电镜分析的用户,这样我们才能不断提高F1赛车的技术水平。然后再将这些技术应用到普通汽车上。我觉得必须要有这样一个过程。有很多学者力求上进,不断突破自己,最后成就了自我,但是这不并代表你能够写出有影响力的文章。富士山拔地参天,景色宜人,源于其山脚下广阔的原野。我就想做那山脚下的原野。”
据悉,泽口教授在选择电镜解剖学研究时,分子生物学正处于快速发展阶段,行业前辈们也多次劝诫他不要鲁莽,但他还是因为热爱选择了这条路。泽口教授十分热爱电镜行业,他怀揣着这份热爱,倾心投入到新治疗法等的基础研究中,作为教育者点亮了下一代人的梦想。他心中暗下决心:“我还能再突破”。

教授先生和学生

宫崎大学医学部解剖学讲座 超微形态科学领域 Web网站

泽口教授讲座详细介绍电镜分析的魅力、样品制备的实验报告、观察实例,链接如下:
生物医学电镜研究网 透射电子显微镜 首页

请参照“医学生物学领域的透射电镜样品制备法”“透射电镜观察和拍摄法”“透射电镜的高分辨展示出各种脏器细胞和组织内部结构的图像集锦”。

编者按

样品制备是通过光学显微镜对准含iPS细胞的切片,再根据不同实验目的利用透射电镜捕捉样品的形貌。《SI NEWS》第58-1期刊中介绍了泽口教授课题组研发成功的关键因素-“树脂包埋辅助工具”,它其实就是百元商店里偶然发现的鸡眼贴。采访当天泽口教授也拿了很多鸡眼贴,说道:“我并不是什么怪癖之人,但是我喜欢做别人没做过的事”。如他所说,他以独特的视角和研究方向,为电镜研究开拓了更多的可能性。永葆初心,大力弘扬One for All精神。“如果我的举手投足会影响将来的医学科研学者,那我会更加严于律己”。在采访休息间隙,泽口教授和同学们有说有笑,谈吐间我能感受到他身上散发的正能量,以及勇于挑战的拼搏精神。

(石桥今日美)