通过色谱柱切换实现预处理的自动化

对生物样品或含有大量杂质成分的样品进行分析时，有必要实施蛋白质或杂质成分的去除及浓缩等预处理。预处理操作对分析结果造成重大影响，是非常重要的因素。而且操作过程中的很多细节依靠分析人员的操作经验和熟练程度，因此进行“稳定的预处理操作”是极为重要的一步。

预处理方法，使用较为广泛的是固相萃取法或色谱柱切换法。
Chromaster系统采用了选择阀，由此可以通过色谱柱切换方式实现自动化预处理。以血清中药物的分析研究为例进行介绍。

色谱柱切换方式来分析血中的苯妥英

样品制备

人体血清中添加苯妥英后，离心后取上清液，即可。

目的

研讨苯妥英分析的自动化预处理。

* 苯妥英为抗癫痫药，其有效血药浓度为10 - 20 µg/mL，血药浓度超过20 µg/mL以上被认为是中毒范围。

仪器配置

Chromaster 5110泵
Chromaster 5210自动进样器
Chromaster 5310柱温箱（装配2位6通阀）
Chromaster 5420紫外-可见检测器

高效液相色谱仪 Chromaster

色谱条件

流动相	(A) 50 mM KH₂PO₄-K₂HPO₄(pH6.9)/CH₃CN=95/5 (B) CH₃CN ^*(A)/(B) = 65/35
流速	1.0 mL/min
色谱柱	HITACHI LaChrom C18 (5 µm) (4.6 mm I.D. x 150 mm) (P/N: 891-5050)
柱温	40°C
检测波长	210 nm

预处理条件

流动相	(A) 50 mM KH₂PO₄-K₂HPO₄(pH6.9)/CH₃CN = 95/5 (B) CH₃CN ^*(A)/(B) = 95/5
流速	1.0 mL/min
进样量	20 µL
预处理柱	Mspak PK-4A(4.0 mmI.D. x 10 mm, Shodex)^*注释1
柱温	40°C

*:注释1：其特点为：色谱柱切换分析用预处理柱中，不保留蛋白质而只保留小分子物质。

色谱柱切换预处理法的研讨

对血清中的苯妥英（抗癫痫药）进行分析时，需要去除蛋白质等成分。
因此，研究讨论了用前处理柱去除蛋白质后只将苯妥英（目标成分）导入色谱柱的方法。

关于前处理柱条件的研讨（1）

目的

确认蛋白质的洗脱条件

预处理条件

流动相	(A) 50 mM KH₂PO₄-K₂HPO₄(pH6.9)/CH₃CN=95/5 (B) CH₃CN ^*(A)/(B) = 95/5
流速	1.0 mL/min
进样量	20 µL
色谱柱	Mspak PK-4A (4.0 mmI.D. x 10 mm, Shodex)
柱温	40°C

结果

确认了蛋白质等成分未被色谱柱保留并得以洗脱。

预处理柱条件的研讨（2）

确认将目标成分（苯妥英）导入到色谱柱的条件。
苯妥英STD 10 mg/L（进样量20 µL）、检测波长254 nm。

预处理条件

流动相	(A) 50 mM KH₂PO₄-K₂HPO₄(pH6.9) (B) CH₃CN
流速	1.0 mL/min
色谱柱	Mspak PK-4A (4.0 mmI.D. x 10 mm, Shodex)
柱温	40°C

色谱柱条件的研讨

确认目标成分（苯妥英）被保留在色谱柱并得以分离的条件。
在苯妥英STD 10 mg/L（进样量20 µL）、检测波长254 nm。

色谱条件

流动相	(A) 50 mM KH₂PO₄-K₂HPO₄(pH6.9) (B) CH₃CN
流速	1.0 mL/min
色谱柱	LaChrom C18 （5 µm）（4.6 mm I.D × 150 mm）
柱温	40°C

结果

将苯妥英从预处理柱导入至色谱柱后，色谱条件设定为A/B = 60/40。

关于阀切换时间的研讨

将血清导入到预处理柱，确认去除蛋白质所需时间。（280 nm波长下检测蛋白质）
→此次将阀切换时间设定为5分钟。
根据前述前处理柱条件的探讨结果，决定了流动相的比例。

通过色谱柱切换的分析结果

样品制备

人的血清中添加苯妥英标准样品（10 µg/mL）而成。

* 离心分离后的上清液上机测试

此次通过自动化前处理，苯妥英的回收率达到了：85.3%，10 µg/mL上时的保留时间的重现性达到CV：0.04%，峰面积值的重现性达到CV：1.91%。
苯妥英的有效血药浓度为10 - 20 µg/mL，血药浓度超过20 µg/mL时，将被认为中毒范围，而此次已确认采用本方法，可以进行高精度分析。

请参阅这里的印刷文件。（PDF格式，493KB）

本资料所示数据仅为测定例用数据而非可保证仪器性能的数据。
本仪器只是研究用仪器，而不是诊断、治疗或预防人或动物疾病的医疗仪器。