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日立ハイテク
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HPLC Chromaster(クロムマスター)
-アミノ酸分析の紹介(Chromaster NINポストカラム標準分析法)-

自然界に存在するアミノ酸は数百種類あることが知られていますが、タンパク質やペプチドを構成するアミノ酸は約20種類です。このアミノ酸を対象とした分析法を日立ハイテクでは、「標準分析法」と呼んでいます。それに対し遊離アミノ酸約40成分を対象とした分析法を「生体液分析法」と呼んでいます。
またアミノ酸はUV吸収が弱いため、通常は誘導体化して測定します。カラム溶出後反応試薬を混合するポストカラム法の誘導体化試薬には、ニンヒドリン(NIN*1)とオルトフタルアルデヒド(OPA*2)があり、それぞれ異なった特徴があります。
今回は、タンパク質加水分解アミノ酸を対象とし、ニンヒドリン試薬を用いたポストカラム法を紹介いたします。この試薬は安定で、寿命が長いことが特長です。溶離液と反応液は、市販キットを使用できます。また再現性も良好でルーチン分析に向いています。検出は、これまで570 nmで行っていましたが、5420 UV-VIS検出器の2波長測定機能を用い440 nmを同時に測定することでPro(プロリン)の感度向上を図りました。

*1 *NIN:ニンヒドリン(ninhydrin)

*2 OPA:オルトフタルアルデヒド(o-phthalaldehyde)

アミノ酸分析法の種類と特徴:

アミノ酸分析法の種類と特徴の図解

アミノ酸分析システム(NINポストカラム法)

-
NINによる誘導体化反応の図解
流路図

アミノ酸標準試料測定例

アミノ酸標準試料測定例のグラフ
No. 各ピークの成分名 No. 各ピークの成分名
1 ASP Aspartic acid[アスパラギン酸] 10 Met Methionine[メチオニン]
1 ASP Aspartic acid[アスパラギン酸] 10 Met Methionine[メチオニン]
2 Thr Threonine[スレオニン] 11 Ile Isoleucine[イソロイシン]
3 Ser Serine[セリン] 12 Leu Leucine[ロイシン]
4 Glu Glutamic acid [グルタミン酸] 13 Tyr Tyrosine[チロシン]
5 Pro Proline[プロリン] 14 Phe Phenylalanine[フェニルアラニン]
6 Gly Glycine[グリシン] 15 Lys Lysine [リジン]
7 Ala Alanine[アラニン] 16 His Histidine[ヒスチジン]
8 Cys Cystine[シスチン] 17 Arg Arginine[アルギニン]
9 Val Valine[バリン]      

標準分析法測定条件:

カラム #2619PH 4.0 mm I.D. × 150 mm
アンモニアフィルタカラム #2650L 4.0 mm I.D. × 120 mm
ガードカラム #2619 4.0 mm I.D. × 5 mm
溶離液 MCI緩衝液L-8500 PH-Kit (PH-1、PH-3、PH-4、PH-RG)
流量 0.4 mL/min
カラム温度 57°
反応液 ニンヒドリン試液ワコーアミノ酸自動分析装置用キット
(識別記号: 日立用) (R1/R2=50/50)
反応液流量 0.3 mL/min
反応温度 130°
検出波長 VIS 440nm、570 nm(2波長同時測定)
注入量 20 µL

* 販売元:和光純薬工業株式会社

バリンとヒスチジンの直線性
   

Proを除く16成分の検量線は、0.05~15 nmol/20 µLの範囲で寄与率0.9996以上と良好な直線性を示しました。

BSA加水分解中のアミノ酸測定例

BSA(牛血清アルブミン)加水分解溶液の測定例

前処理(加水分解):

前処理方法のフロー

分離用溶離液に3液を使用することで、分離の改善を図りました。特にIle-Leuの分離が向上しました。 BSA測定例において、Proは570 nmで検出が困難ですが、440nmで同時に測定することで検出が可能になりました。

薄口醤油中のアミノ酸測定例

薄口醤油の測定例

試料の前処理:

試料の前処理のフロー

本分析条件では、他のアミノ酸と同時にGABA(γ -アミノ酪酸)とOrn(オルニチン)も検出されています。

醤油など発酵食品に含まれるアミノ酸の網羅的な測定には、より多くのアミノ酸を同時に測定できる「生体液分析法」も選択いただけます。

注意:本掲載データは測定例を示すもので、数値を保証するものではありません。
本製品は研究用です。診断用ではありません。

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